橙皮苷通過MeCP2/Wnt軸對口腔鱗狀細胞癌惡性生物學行為的作用機制

李國芳 韓永付 鄭 雷 李曉琰 高振杰

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous-cell carcinoma，OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其發病率居口腔癌首位，且逐年攀升并趨于年輕化[1]。目前臨床治療OSCC通常采用化療聯合手術切除，但由于腫瘤生長位置特殊，可能會損壞患者面部形象或造成面部器官功能障礙，治療效果并不理想[2]。此外，OSCC隱蔽性強，部分患者確診時已處于晚期，出現組織浸潤及淋巴結轉移，以致患者病死率居高不下[3]。橙皮苷是柑橘類成熟果皮和組織中的類黃酮物質，有研究證明，其可通過抑制人肝癌和神經母細胞瘤細胞增殖并誘導其凋亡來發揮抗癌功效[4]。然而，目前關于其對于OSCC細胞的作用及相關機制鮮有報道。本研究采用橙皮苷干預OSCC細胞，觀察其對該細胞克隆、遷移、侵襲等惡性生物學行為的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人OSCC CAL27細胞系、人口腔黏膜角質形成細胞(Human Oral Keratinocytes，HOK)系，購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 藥物、主要試劑、儀器 橙皮苷(純度>98%，上海源葉生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取試劑盒、pcDNA 3.1-甲基化CpG結合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)質粒(上海聯碩生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000試劑盒(上海臻諾生物科技有限公司)，兔抗人MeCP2、Wnt-1、β-連環蛋白(β-catenin)、腺瘤樣結腸息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白一抗(美國Santa公司)。

倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)，DYCZ-24電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Gel Doc XR+一體式凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人OSCC CAL27細胞、HOK細胞置于DMEM培養基(含有10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素雙抗)中，37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，每2～3 d更換一次培養液，細胞融合至80%后，采用胰蛋白酶消化、傳代，選取對數生長期細胞作為實驗對象。

1.2.2 Western blot法檢測MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量 取HOK、CAL27對數期細胞，加入預冷RIPA細胞裂解液，注入離心管，以10000 r/min，離心半徑r=10 cm離心15 min，BCA法測定蛋白含量。取50 μg待測蛋白，按比例與上樣緩沖液混合，經水煮沸5 min，同條件離心取其上清，80 V恒壓上樣電泳后濕轉至硝酸纖維素膜，封閉液室溫搖床封閉2 h，TBST清洗，加入兔抗人MeCP2一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發光液顯色，暗室曝光，經一體式凝膠成像系統分析，以MeCP2蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示蛋白表達量。

1.2.3 細胞干預、轉染、分組[5]取對數期CAL27細胞，PBS洗滌，調整細胞密度為1×105個/mL，接種至6孔板，待細胞再次融合至60%時，分為空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組。空白組不處理，橙皮苷組培養基加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)，MeCP2過表達組根據LipofectamineTM3000試劑盒說明書步驟，轉染MeCP2蛋白過表達質粒pcDNA 3.1-MeCP2，橙皮苷+MeCP2過表達組轉染pcDNA 3.1-MeCP2后，加入橙皮苷(100 μmol/L終濃度)。每組設置5個復孔，干預或轉染48 h后進行后續實驗。

1.2.4 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量 取各組細胞，操作同1.2.2。

1.2.5 平板克隆實驗檢測各組克隆能力 轉染48 h后，取各組細胞經胰蛋白酶消化、傳代，吹打為單個細胞，以細胞密度300個/mL接種于培養皿中(含培養液10 mL)，置于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養，每2～3 d更換一次培養液，待出現肉眼可見的克隆細胞時，終止培養。棄其上清液，PBS洗滌干凈，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，棄去固定液，PBS洗滌，加入結晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風干，將平皿倒置于透明膠片上，低倍鏡下記錄克隆數并拍照。

1.2.6 劃痕實驗檢測各組遷移能力 取各組對數期細胞，經胰蛋白酶消化、重懸。以1×106個/mL接種至6孔板，培養至細胞貼壁，吸去培養基，用移液器槍頭沿孔板中央垂直向下畫一條直線，PBS輕吹除去邊緣細胞碎片，置于完全培養基繼續培育24 h，置于顯微鏡下拍照記錄培養前劃痕寬度及培育24 h后劃痕寬度，觀察細胞遷移情況，計算各組遷移率。遷移率=(培養前劃痕寬度-培育24 h后劃痕寬度)/培養前劃痕寬度×100%。

1.2.7 Transwell實驗檢測各組侵襲能力 取Matrigel膠冰浴融化，加入PBS稀釋，以50 μL/孔置于Transwell小室濾膜上，取各組OSCC CAL27細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于Transwell小室上層，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養箱中培養48 h，取出杯底濾膜，PBS沖洗，加入0.25%戊二醛固定15 min，加結晶紫染液37 ℃染色25 min，自來水沖洗，風干。顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照并記錄各視野穿模細胞數，取其均值。

1.2.8 Western blot法檢測Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達量 取各組細胞。同1.2.2洗滌、裂解、定量、變性、電泳、轉膜、孵育。分別加入相應抗體Wnt-1、β-catenin、APC一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，加入ECL發光液顯色，暗室曝光，經一體式凝膠成像系統分析，以目的蛋白與內參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MeCP2在HOK、CAL27細胞系中的蛋白表達量

HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量分別為(0.43±0.03)、(0.61±0.05)，與HOK細胞系比較，MeCP2在CAL27細胞系中蛋白表達量升高(t=6.903，P<0.05)。見圖1。

圖1 Western blot法檢測HOK、CAL27細胞系中MeCP2蛋白表達量

2.2 轉染后MeCP2蛋白表達量

轉染48 h后，空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量分別為(0.63±0.06)、(0.24±0.02)、(0.94±0.09)、(0.41±0.04)，與空白組比較，橙皮苷組MeCP2蛋白表達量降低，MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量升高(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組MeCP2蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組MeCP2蛋白表達量

2.3 克隆能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數分別為(203.00±29.93)個、(74.50±10.52)個、(285.00±35.41)個、(122.50±19.97)個，與空白組比較，橙皮苷組克隆數減少，MeCP2過表達組克隆數增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數增加(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組克隆數減少(P<0.05)。見圖3。

圖3 平板克隆實驗檢測克隆能力

2.4 遷移能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率分別為(71.88±8.23)%、(51.67±5.37)%、(90.36±9.52)%、(64.44±6.74)%，與空白組比較，橙皮苷組遷移率降低，MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率升高(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組遷移率降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 劃痕實驗檢測遷移能力(×100，標尺50 μm)

2.5 侵襲能力比較

空白組、橙皮苷組、MeCP2過表達組、橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數分別為(70.40±7.60)個/視野、(13.40±3.80)個/視野、(124.60±13.80)個/視野、(38.20±4.40)個/視野，與空白組比較，橙皮苷組侵襲細胞數減少，MeCP2過表達組侵襲細胞數增加(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數增加(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組侵襲細胞數減少(P<0.05)。見圖5。

圖5 Transwell實驗檢測侵襲能力(×200，標尺200 μm)

2.6 Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達比較

與空白組比較，橙皮苷組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高，MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低(P<0.05)；與橙皮苷組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低(P<0.05)；與MeCP2過表達組比較，橙皮苷+MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達降低、APC蛋白表達升高(P<0.05)。見表1，圖6。

圖6 Western blot法檢測各組Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

表1 各組細胞Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表達

3 討論

OSCC是源自口腔黏膜的鱗狀細胞癌，早期通常表現為表淺潰瘍，逐漸出現病理性白斑、紅斑，進而進展為腫瘤侵入口腔內部組織[6],其危險因素包括不良生活習慣，如吸煙、飲酒、食用檳榔、感染HPV等[7]。目前關于OSCC的發病機制尚不明確，研究認為其與基因突變、微小RNA調控、抑癌基因產物改變DNA代謝調節有關[8]。惡性程度高、病程發展快、侵襲性強、復發率高是OSCC的主要特征，且多數患者確診時已出現淋巴結轉移，是高復發率和病死率的重要原因[9]。由此可見，研究抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移等惡性細胞學行為的方式，是提升患者生存率，改善預后的有效途徑。

近年來，天然提取物常被用于抗癌治療，因其高效、低副作用的特點，已成為臨床研究熱點。橙皮苷廣泛存在于柑橘屬、蕓香科、茜草科、十字花科植物果實或根莖中，具有抗炎、抗衰老、提升免疫力、保護心腦血管、防止血液凝聚及抗癌等多種生物學活性[10]。L等[11]在研究橙皮苷的抗癌活性及其作用機理時發現，其可抑制體外人前列腺癌細胞活力，阻滯細胞周期，促進其凋亡，并降低其遷移、侵襲能力，提示其具有潛在的體外抗癌作用。作為天然抗氧化保健品，橙皮苷及其衍生物可清除超氧陰離子自由基，減少DNA損傷，降低腫瘤發生風險[12]。本研究結果顯示，與空白組比較，橙皮苷組克隆數、侵襲細胞數減少，遷移率降低，提示橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移。

DNA甲基化是引發抑癌基因失活的重要原因之一[13]。MeCP2蛋白是甲基化結合蛋白家族成員，可與甲基化DNA結合或經轉錄因子識別甲基化DNA，進而調控其下游蛋白表達，參與增殖、侵襲、遷移、凋亡等多種細胞功能調控[14]。有研究表明[15]，MeCP2在乳腺癌細胞中異常高表達，敲降MeCP2可抑制細胞增殖，阻滯細胞周期并誘導其凋亡。Wnt/β-catenin信號通路是引發腫瘤的重要通路之一，其中Wnt1表達水平與該信號通路活性有關。APC是一種抑癌基因，其蛋白參與β-catenin濃度調控。正常細胞內β-catenin與APC結合呈低表達狀態。腫瘤細胞內，APC基因缺失或突變，β-catenin大量游離，進入核內參與調控基因表達，誘發Wnt/β-catenin信號通路異常激活[16]。Zhang等[17]研究認為，MeCP2高表達可激活Wnt/β-catenin信號傳導途徑來促進OSCC細胞增殖，促進OSCC發展。本研究結果顯示，與HOK細胞系比較，CAL27細胞系MeCP2蛋白表達量升高，提示MeCP2在OSCC細胞異常低表達；與空白組比較，MeCP2過表達組Wnt-1、β-catenin蛋白表達升高，APC蛋白表達降低，且與橙皮苷聯用可減弱轉染MeCP2對OSCC惡性行為的影響，提示橙皮苷抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移的機制可能與調控MeCP2，進而調控Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，橙皮苷可抑制OSCC細胞克隆、侵襲、遷移，其作用機制可能與抑制MeCP2，進而抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。