沉默LAMC2基因對口腔鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡的影響

黃瑩瑩 李海朋 裴 浩

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)來源于口腔上皮細胞，是頭頸部最常見的惡性腫瘤，已被列為世界第八大惡性腫瘤，由于其具有高發生率、高致死率和高轉移率，所以OSCC一直都是臨床工作者的關注重點。層粘連蛋白γ2(laminin γ2 chain gene，LAMC2)是層粘連蛋白家族中的一員，研究發現，LAMC2在食管鱗癌中高表達[1]，此外，LAMC2可增強卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，通過調節細胞賴以生存的微環境的pH值，促進胰腺癌細胞的清洗和遷移[2-3]。血清LAMC2可作為肝癌預后的診斷標志物[4]。Wang等研究報道稱人OSCC細胞分泌的細胞外囊泡中富集大量LAMC2，可促進體外淋巴管再生[5]，但該基因對癌細胞的惡性行為學的影響未進行探討，因此本研究以人舌鱗癌細胞TSCC為研究對象，探討LAMC2對癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，旨在為臨床治療OSCC提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人OSCC細胞CAL-27購自中科院上海細胞研究所。

1.2 試劑與儀器

含有si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2、LAMC2-NC的pcDNA3.1重組質粒購自上海吉瑪生物科技有限公司；脂質體LipofectamineTM購自美國Thermo公司；MTT試劑盒購自美國Abcam公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒以及PCR引物購自大連寶生物工程有限公司；神經鈣粘蛋白(N-cadherin，N-cad)、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、波形蛋白(vimentin)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；多功能酶標儀購自美國Bio-TEK公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 細胞培養和轉染

將CAL-27細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中，每2 d更換一次培養基，待細胞生長至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，并傳代，待細胞傳至第4代時用于實驗。

將對數生長期的細胞重懸，制成細胞密度為1×105的細胞懸液，接種于96孔板，置于培養箱中培養，待細胞融合度達到80%時。將細胞隨機分為對照組、si-NC組、si-LAMC2組、LAMC2-NC組、LAMC2組。對照組細胞不做任何處理，其余4組分別轉染si-NC、si-LAMC2、LAMC2-NC、LAMC2，顯微鏡下觀察轉染效果，待轉染成功率達到85%時，進行以下實驗。

1.4 qRT-PCR法檢測LAMC2的表達

轉染48 h后，收集各組細胞，利用RNA試劑盒提取細胞中總RNA，分光光度計測定RNA濃度和純度，利用逆轉錄試劑盒，將RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參基因，進行PCR擴增，反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環，數據采用2-△△CT法計算LAMC2的表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 MTT法檢測細胞存活率

轉染48 h后，收集細胞將細胞重懸，以5×103/個細胞/孔的密度接種于24孔板，培養箱中培養24 h后，換含有0.5% MTT溶液的培養基繼續培養4 h，棄去培養基，每孔中加入100 μl DMSO，振蕩混勻后，置于酶標儀上測定波長570 nm處的吸光度(A值)，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

轉染48 h后，3000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，收集對數生長期的細胞。冰PBS清洗細胞2次，加入400 μl Binding Buffer將細胞重懸，加入5 μl annexin V避光反應20 min，再加入4 μl碘化丙啶，振蕩混勻后，室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Transwell實驗檢測侵襲細胞數

轉染48 h后，無血清培養基將細胞重懸，制成密度為1×105個/ml的細胞懸液。將100 μl細胞懸液接種于經Matrigel基質膠包被的Transwell小室的上室中，下室中加入含20%胎牛血清的培養基，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后，棄掉下室中的培養基，棉簽擦去上室膜上的細胞，甲醛固定下室中入侵的細胞，0.5%結晶紫染色10 min，顯微鏡下觀察并計數。

1.8 蛋白印跡法檢測細胞中E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量

轉染48 h后，收集細胞，加入40 μl RIPA裂解液，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100 ℃煮沸10 min使蛋白處于穩定狀態。凝膠電泳，每孔20 μl蛋白樣品，80 v電泳20 min，使蛋白樣品至分離膠后120 v恒壓電泳2 h，電泳結束后，0.3 A恒流濕轉2 h，將蛋白濕轉至PVDF膜上。TBST洗膜3次，5 min/次，室溫封閉1 h，E-cad、N-cad、vimentin、GAPDH一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，5 min/次，ECL法顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH灰度值表示。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測結果

LAMC2表達組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組LAMC2表達降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組LAMC2表達升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組LAMC2表達升高(P<0.05)，見表2。

表2 LAMC2表達量比較

2.2 細胞存活率檢測結果

細胞存活率組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細胞存活率降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細胞存活率差異無統計學意義(P>0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細胞存活率升高(P<0.05)，見表3。

表3 細胞存活率比較

2.3 細胞凋亡率檢測結果

細胞凋亡率組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組細胞凋亡率降低(P<0.05)，見表4。

表4 細胞凋亡率比較

2.4 侵襲細胞數檢測結果

侵襲細胞數組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組侵襲細胞數減少(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組侵襲細胞數增多(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組侵襲細胞數增多(P<0.05)，見表5。

表5 侵襲細胞數比較

2.5 蛋白印跡法檢測結果

E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量組間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組和si-NC組比較，si-LAMC2組E-cad蛋白相對表達量升高，N-cad、vimentin蛋白相對表達量降低(P<0.05)；與對照組和LAMC2-NC組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與si-LAMC2組比較，LAMC2組E-cad蛋白相對表達量降低，N-cad、vimentin蛋白相對表達量升高(P<0.05)。見表6、圖1。

表6 E-cad、N-cad、vimentin蛋白相對表達量比較

注：A為對照組;B為si-NC組;C為si-LAMC2組;D為LAMC2-NC組;E為LAMC2組。

3 討論

頭頸部常見的惡性腫瘤中，約90%以上為OSCC[6]，其病因包括遺傳、環境、感染等因素，好發于40～60歲煙酒嗜好者。目前對于OSCC的治療以手術、放化療及免疫治療為主，雖然治療手段已取得巨大進展，但患者5年生存率仍不理想，僅有50%[7]。OSCC可發生早期頸部淋巴結轉移，具有極高的隱匿性，據統計，約40%患者早期即發生隱匿性頸部淋巴結轉移，導致術后復發率極高，這可能與高病死率有關。因此尋找新的治療靶點對OSCC患者預后不良具有重要意義。

層粘連蛋白是一類大分子糖蛋白，主要存在于上皮細胞、神經視網膜細胞的基質上，該分子蛋白通常由α鏈、β鏈和γ鏈組成，形成十字形結構[8]。LAMC2、LAMB3、LAMA3三個亞基組成異三聚體糖蛋白層粘連蛋白5，特異性表達于上皮細胞，在上皮細胞的遷移過程中具有重要作用。LAMC2僅在層粘連蛋白5中存在，對層粘連蛋白5的生理功能具有重要作用。LACM2已被報道與多種腫瘤的發生有關，Huang等[9]研究發現LAMC2過表達可預測結直腸癌患者預后不良，并促進癌細胞增殖、遷移和侵襲。LAMC2在喉癌細胞和組織中高表達，且LAMC2表達水平與TNM分級、淋巴結轉移、分化和總生存期相關，此外LAMC2顯著促進細胞增殖和細胞活力，可顯著逆轉西妥昔單抗抑制喉癌細胞增殖的作用[10]。長鏈非編碼RNA00511通過海綿吸附于miR-765上調LAMC2的表達，促進舌鱗狀細胞癌的進展[11]。由此可見，LAMC2基因可能成為治療癌癥的新的治療靶點，但是LAMC2對OSCC癌細胞行為學的影響鮮有報道，因此本研究以CAL27細胞為研究對象，上調或敲降細胞中LAMC2的表達，檢測癌細胞的增殖、凋亡和侵襲能力。結果顯示：過表達LAMC2后癌細胞增殖和侵襲能力增強、凋亡率降低，敲降LAMC2的表達后，癌細胞增殖和侵襲能力減弱，凋亡率升高。結果提示：LAMC2促進OSCC的惡性行為學。

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一個復雜的轉化過程，發生在上皮細胞和間質細胞之間，當上皮細胞受到某些刺激因素時，上皮細胞丟失原有特性，形態由原來的規則形態轉變成梭形的不規則形態，細胞骨架發生重構排列，細胞極性改變，使其具有間質細胞特性，極性改變提高細胞遷移能力，增強對周圍組織的侵襲[12]。該過程常發生于胚胎發育、組織纖維化以及癌細胞遷移和侵襲過程，所以在多數腫瘤的遷移和侵襲中均發生上皮細胞向間質細胞轉化的過程。Wang等[13]研究發現GIT1誘導EMT過程促進肝細胞癌遷移和侵襲。miR-29b抑制EMT過程可降低癌細胞遷移和侵襲能力，以及血管再生能力[14]。Okada等[15]報道稱LAMC2逆轉EMT過程可抑制胰腺癌的進展并增強化療藥物敏感性。發生EMT主要表現在上皮細胞表面標記蛋白E-cad表達下降，間質細胞表面標記物N-cad和vimentin蛋白表達上升，E-cad屬于鈣粘蛋白家族成員，主要介導細胞間連接和黏附，N-cad和vimentin蛋白與癌細胞遷移侵襲、化療藥物耐藥、預后不良等密切相關。

既往研究表明，層粘連蛋白5的3個亞基LAMC2、LAMB3、LAMA3均可促進EMT過程從而癌細胞發生遷移和侵襲[16]。本研通過蛋白印跡法檢測LAMC2對OSCC細胞癌中E-cad、N-cad、vimentin蛋白表達情況。結果顯示：上調LAMC2后，E-cad蛋白表達降低，而N-cad和vimentin蛋白表達升高，敲降LAMC2后各蛋白表達出現相反趨勢。結果提示：LAMC2促進OSCC的EMT過程。

綜上所述，LAMC2促進OSCC癌細胞增殖和侵襲、抑制凋亡，其可能是通過誘導EMT過程發揮調控作用，為臨床治療OSCC提供理論依據。