膠體金免疫層析法快速檢測禽蛋中甲硝唑殘留分析研究

張 瑜 ，惠光朋 ，王志恒，譚 晨 ，劉 冰，崔廷婷 *

（1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京；3.河北省石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心，河北 石家莊）

作為一種硝基咪唑類藥物，甲硝唑具有較強(qiáng)的抗厭氧菌作用，在畜禽養(yǎng)殖過程中廣泛用于防治球蟲病、組織滴蟲病和六邊蟲病等[1-2]。動物源性食品中甲硝唑殘留會引起消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿道的毒副反應(yīng)，導(dǎo)致皮膚過敏及過敏性休克[3]；動物試驗(yàn)結(jié)果表明，甲硝唑有潛在的致癌性[4]。許多國家和地區(qū)都已將其列入動物源性食品中禁止使用的化合物清單[5]，我國也對硝基咪唑類藥物進(jìn)行了嚴(yán)格限制，2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局公告2019 年第114 號，GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定甲硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出[6]。然而，禽蛋中甲硝唑殘留風(fēng)險(xiǎn)現(xiàn)狀卻不容樂觀，劉青等[7]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定樣品中甲硝唑和氯霉素殘留量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2016-2019 年，陜西省雞蛋中甲硝唑檢出率為12.10 %（34/281）；紀(jì)律等[8]在湖北省13 個(gè)市州和潛江市、仙桃市的大型超市和農(nóng)貿(mào)市場采集市售雞肉及雞蛋樣品168 件，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測甲硝唑的殘留量，結(jié)果甲硝唑檢出率4.17 %（7/168）。可見，建立快速、準(zhǔn)確檢測禽蛋中甲硝唑殘留的方法， 對于保障禽蛋產(chǎn)品質(zhì)量安全、保護(hù)消費(fèi)者健康至關(guān)重要。

目前已報(bào)道的檢測甲硝唑殘留的方法主要有色譜法[9-10]和色譜-質(zhì)譜法[1,11-13]。但這些方法需要由專業(yè)的技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室使用昂貴的儀器設(shè)備來完成，檢測成本高、費(fèi)時(shí)長，難以在基層推廣使用。膠體金免疫層析技術(shù)作為近年最快速的新型檢測技術(shù)之一，在真菌毒素、農(nóng)獸藥殘留、非法添加劑、病原微生物等檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14]。該技術(shù)操作簡便、成本低、不需特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀且靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，適合作為初篩手段用于儀器確證方法的補(bǔ)充。本文對膠體金試紙條檢測禽蛋中甲硝唑的殘留進(jìn)行了研究，為甲硝唑殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋，市售；甲硝唑殘留檢測試紙條（包含膠體金試紙條、樣本提取劑、NaCl 溶液、樣本稀釋液），北京勤邦生物技術(shù)有限公司；甲硝唑、奧硝唑、塞克硝唑、替硝唑、地美硝唑、羥甲基硝唑、洛硝唑、羥基異丙硝唑、異丙硝唑標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99%），美國Sigma 公司。

2000SBL 電子天平（感量 0.01 g），美國Setra 公司；QL-901 旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；DSY-Ⅴ型氮吹儀，北京東方精華苑科技有限公司；微量移液器（單道20～200 μl、100～1 000 μl），美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將鮮蛋破碎至燒杯中，蛋清蛋黃充分混勻；稱取2.00±0.05 g 混勻的樣本至10 ml 聚苯乙烯離心管中，加入0.5 ml NaCl 溶液，渦旋2 min，再加入3 ml 樣本提取劑，渦旋2 min，3 000 r/min 室溫離心5 min；取2 ml 上層有機(jī)相至10 ml 聚苯乙烯離心管中，于50～60 ℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?00 μl 樣本稀釋液，渦動30 s 后待測。

1.2.2 檢測步驟 吸取100 μl 待測液于試紙條加樣孔中，液體流動時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)8 min 后，根據(jù)檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C 線）的顏色深淺即可判定結(jié)果。檢測結(jié)果示意圖見圖1。

圖1 檢測結(jié)果示意圖

1.2.3 樣本檢出 限試驗(yàn)采用1.2.1 所述的方法進(jìn)行樣品前處理時(shí)，在空白雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣本中添加甲硝唑至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.25、0.5、1、2、5、10 μg/kg，用試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)重復(fù)，記錄檢測結(jié)果，確定試紙條肉眼判定禽蛋中甲硝唑的檢出限。

1.2.4 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 取空白雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣本各20 份，按1.2.1 所述方法進(jìn)行前處理后，用試紙條進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)陽性結(jié)果，計(jì)算假陽性率；取空白雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣本各20 份，分別添加甲硝唑至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg，按1.2.1所述方法進(jìn)行前處理后，用試紙條進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)陰性結(jié)果，計(jì)算假陰性率。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 取甲硝唑、奧硝唑、塞克硝唑、替硝唑、地美硝唑、羥甲基硝唑、洛硝唑、羥基異丙硝唑、異丙硝唑標(biāo)準(zhǔn)品，配制成不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測試，驗(yàn)證試紙條的特異性。

1.2.6 實(shí)際樣品的測試 在大型連鎖超市、生鮮便利超市和農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場隨機(jī)購買雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋盲樣各10 份，分別用試紙條和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（Liquid chromatography tandem-mass spectrometry，LC-MS/MS）檢測甲硝唑殘留情況。LC-MS/MS 檢測條件及前處理過程參考SN/T 2624-2010《動物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[15]，在北京安為天檢測技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢出限試驗(yàn)

雞蛋樣本檢出限試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示，隨著甲硝唑添加濃度的增加，T 線顯色逐漸變淡，至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 μg/kg 時(shí)，T 線顯色明顯弱于C線，為陽性。其他禽蛋樣本檢出限測定結(jié)果如表1 所示，由此確定該試紙條肉眼判斷禽蛋中甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg。

表1 試紙條檢出限測定結(jié)果

圖2 試紙條檢出限試驗(yàn)結(jié)果（雞蛋樣本）

2.2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)

準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，20 份空白雞蛋、鵪鶉蛋樣本中各檢出1 份陽性樣本，假陽性率為5 %；20 份空白鴨蛋樣本中未檢出陽性樣本，假陽性率為0 %，說明試紙條具有較好的陰性分辨率。陽性雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋樣本檢測結(jié)果均為陽性，假陰性率均為0%，說明試紙條具有穩(wěn)定的檢測能力。

表2 試紙條準(zhǔn)確性測定結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，試紙條對甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg，對其他8 種硝基咪唑類藥物的檢出限相對較高。可見，本試紙條用于檢測甲硝唑殘留的特異性更高，同時(shí)還可用于初步檢測其他8 種硝基咪唑類藥物殘留。

表3 試紙條特異性測定結(jié)果

2.4 實(shí)際樣品的測試

試紙條和LC-MS/MS 盲樣檢測結(jié)果見表4。試紙條檢測30 份盲樣，檢出3 份陽性樣本；用LC-MS/MS 法檢測，結(jié)果同樣為陽性，說明試紙條可以對禽蛋中的甲硝唑殘留進(jìn)行準(zhǔn)確定性。

表4 實(shí)際樣品測試結(jié)果

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用膠體金免疫層析法對禽蛋中的甲硝唑殘留進(jìn)行快速檢測，膠體金試紙條肉眼判斷禽蛋中甲硝唑的檢出限為0.5 μg/kg，假陽性率≤5 %，假陰性率0 %；試紙條與其他8 種硝基咪唑類藥物有交叉反應(yīng)，但甲硝唑的檢出限最低；試紙條對實(shí)際樣本的檢測結(jié)果與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法基本一致，準(zhǔn)確性較高。但SN/T 2624-2010 中的凈化過程采用固相萃取法，要經(jīng)過活化、平衡、上樣、淋洗、洗脫5 個(gè)步驟，操作復(fù)雜，與之相比，膠體金免疫層析法操作簡單、檢測速度快，適合作為一種快速篩查手段，可廣泛用于禽蛋中氯羥吡啶殘留的現(xiàn)場篩查。