氣道滴注PM2.5混懸液并灌胃給予橄欖苦苷的去勢雌性大鼠股骨骨密度及骨礦物鹽含量變化

林曉莉，黃惠娟，楊薈

1 福建中醫藥大學中西醫結合學院，福州 361005；2 廈門大學附屬東方醫院婦產科

女性絕經后出現的以骨量減少、骨微結構改變和骨代謝異常為主要特征的一種原發性骨質疏松稱為絕經后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）。絕經后骨質疏松是導致絕經后女性骨折的重要原因之一［2］。PM2.5 是空氣的主要污染源之一，與呼吸道疾病的發生發展密切相關［3］。我們前期研究［1］發現，去勢雌性SD 大鼠的骨密度低于未去勢大鼠，暴露于一定濃度PM2.5 下的去勢雌性SD大鼠骨密度相較于去勢未PM2.5 暴露的雌性大鼠更低，因此，PM2.5 暴露可能加速PMOP 的發生和發展。橄欖苦苷是一種提取自橄欖葉的化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌及保護心腦血管等作用［4］。動物研究［5］發現，橄欖苦苷可增加去勢力小鼠左股骨骨密度。但橄欖苦苷對PM2.5 暴露下的去勢大鼠骨密度的影響如何，目前相關研究較少。為此，2021年3-9 月，我們觀察了道滴注PM2.5 混懸液并灌胃給予橄欖苦苷的去勢雌性SD 大鼠左股骨骨密度及骨礦物鹽含量變化，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 30 只8 周齡SPF 級健康雌性性成熟Sprague-Dawley 大鼠［實驗動物許可證號為SCXK（浙）2019-0002］，體質量約200 g，動物實驗管理依照實驗動物管理委員（IACUC）會指導方案進行在中國人民解放軍聯勤保障部隊第九00醫院比較醫學中心動物房單籠飼養（攝入食物59%碳水化合物，7%脂肪，21%蛋白質，13%礦物質），保持干燥、通風、安靜，每日光照時間一定，室溫18 ℃～25 ℃，自由攝食和飲水。動。Thermo Sciencce GUV-15-H-1 大流量采樣器；雙能X 線骨密度儀（型號：HOLOGICDISCOVERYW，美國）。

1.2 大鼠分組、PM2.5 及橄欖苦苷給予方法 30只大鼠適應性喂養1 周后稱量體質量，并按照隨機表法將其分為觀察組20只和對照組10只，觀察組又分為觀察組1、觀察組2，每組10只。

1.2.1 大鼠去勢方法 取30 只SD 大鼠，腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）麻醉。俯臥位固定大鼠，以背部后正中線旁開1.5 cm、雙側肋緣下1 cm 為切口，切開皮膚鈍性分離皮下組織，切開肌層，暴露腹腔，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪，可見脂肪包裹呈粉紅色桑葚狀的卵巢，輕柔分離卵巢下輸卵管與脂肪，組織鉗夾閉卵巢下輸卵管，用慕斯線將輸卵管結扎，剪除卵巢，將斷端輸卵管送回腹腔，間斷縫合肌層、皮膚，用碘伏再次消毒皮膚縫合口。同一方法切除大鼠另一側卵巢。術后于大鼠大腿肌肉內注射青霉素G 鈉鹽40 000 IU。

1.2.2 PM2.5干預方法 ①PM2.5的采集：選取中國人民解放軍聯勤保障部隊第九00醫院舊病房大樓7層為采樣點，用Thermo Sciencce GUV-15-H-1 大流量采樣器采樣。用石英纖維膜（英國Whatman 公司）采集大氣PM2.5。每連續采樣24 h 更換一次濾膜。將采有PM2.5 的濾膜放入密封袋，-20 ℃避光保存。②PM2.5 顆粒制備：將濾膜裁剪成約1 cm×1 cm，置于盛滿去離子水燒杯中，將燒杯放置于超聲清洗器中，超聲低溫震30 min，重復3次，8層無菌紗布過濾燒杯液體。將洗滌液在4 ℃、12 000 r/min高速低溫離心機中離心30 min，棄上清，-20 ℃冰箱過夜并避光保存。第2天將樣本取出，-80 ℃冰箱保存備用。將樣本置于冷凍干燥器，待水分完全揮發后，將瓶底灰色粉末室溫稱重后4 ℃冰箱保存。③PM2.5懸濁液制備：取PM2.5粉末，PBS配制成濃度為2 μg/μL顆粒物懸液，4 ℃保存。懸濁液濃度參考課題組前期研究［1］。④PM2.5 暴露方法：取各組大鼠，乙醚淺麻醉后仰臥位固定，將舌盡可能拉出口腔，暴露咽喉，將靜脈留置針插入氣管約1 cm，將PM2.5 混懸液滴注于氣管之中，待大鼠完成兩次深呼吸（15 s 內）后松舌，左側臥至完全復蘇。每3 天采用PM2.5 混懸液滴注1 次，以第一次氣道滴注當天為第1 天。PM2.5 懸濁液滴注體積為8.25 μL/次，即16.5 μg，三組大鼠暴露劑量相同。

1.2.3 橄欖苦苷灌胃方法 觀察組1、2 在氣道滴注PM2.5 后，分別用50、100 mg/kg 橄欖苦苷溶液灌胃，對照組在氣道滴注PM2.5 后予等量生理鹽水灌胃。

1.3 各組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度及骨礦物鹽含量檢測 第150 天時處死各組大鼠，剝離左股骨，剔除股骨周圍血管神經，將左股骨置于骨密度儀檢查床上，運用雙能X 線骨密度儀（型號：HOLOGICDISCOVERYW，美國）檢測各組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度及骨礦物鹽含量。重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPASS26.0 統計軟件進行數據處理。采用Shapro-Wilk 法對樣本數據進行正態性檢驗，符合正態分布的計量數據以xˉ± s 表示，組間差異比較用方差分析（ANVOA），組內差異用配對樣本t檢驗，不符合正態分布的資料運用秩和檢驗。P＜0.05時為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度比較 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度比較見表1。

表1 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度比較（g/cm2，±s）

表1 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨密度比較（g/cm2，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與左股骨中段比較，ΔP＜0.01；與觀察組1比較，＆P＜0.05。

左股骨中段骨密度0.283±0.003 0.286±0.005 0.271±0.003組別觀察組1觀察組2對照組n 10 10 10左股骨干骺端骨密度0.334±0.013＊Δ 0.349±0.008＊Δ＆0.315±0.003Δ

觀察組1、2 及對照組左股骨中段骨密度與左股骨干骺端骨密度差值分別為0.051±0.014、0.064±0.005、0.043±0.003，與對照組比較，觀察組1、2 大鼠左股骨中段與左股骨干骺端骨密度差值高（P均＜0.05）。

2.2 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨礦物鹽含量比較 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨礦物鹽含量見表2。三組大鼠左股骨中段及左股骨干骺端骨礦物鹽含量差異無統計學意義。

表2 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨礦物鹽含量（g，±s）

表2 三組大鼠左股骨干骺端、左股骨中段骨礦物鹽含量（g，±s）

組別觀察組1觀察組2對照組n 10 10 10左股骨干骺端骨礦物鹽含量0.143±0.010 0.154±0.004 0.147±0.004左股骨中段骨礦物鹽含量0.131±0.003 0.140±0.004 0.132±0.003

3 討論

絕經后骨質疏松是一種發生于絕經后女性的因骨形成和再吸收之間的不平衡而導致的骨質疏松［6］。絕經后女性體內的雌激素水平斷崖式下跌是導致絕經后骨質疏松發生的重要原因之一。當雌激素水平下降可致破骨細胞過度形成和過度的骨吸收［7］。女性在絕經后體內的雌激素水平驟降，失去了對骨的保護作用，更易患骨質疏松［8］。雌激素缺乏可導致人體促炎細胞因子水平增加，加劇體內的骨吸收，導致骨平衡失調［9-10］。絕經后骨質疏松與骨折的發生密切相關，約40%的女性在50歲后將會因骨質疏松而導致骨折［11］。女性因骨質疏松而發生骨折的危險性甚至超過了乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌的總和。目前，在我國的50 歲以上的人群中，女性的骨質疏松的患病率為20.7%，高于男性的14.4%。可見在老年女性中更易因骨質疏松而發生骨折，從側面也說明了絕經后骨質疏松的危害［12］，但目前國內外常用的治療絕經后骨質疏松的藥物都或多或少的存在著一些不良反應［13］。

大氣污染已經是一個世界性問題，人們將空氣中的主要污染物通過顆粒的大小進行劃分，顆粒直徑＜2.5 μm的被稱為PM2.5［1］。PM2.5因其顆粒小、質量輕，極易隨著呼吸進入人體的肺泡中，通過血液循環進入各組織器官，引起相應的神經炎癥反應、氧化應激反應、細胞凋亡、DNA 損傷和染色體畸變、DNA 甲基化，從而導致神經系統的損傷作為主要污染物［1］。PM2.5 在絕經后骨質疏松的發病過程中起到推動作用［1］。PRADA 等［14］在分析了大量因骨質疏松而導致骨折的患者后得出結論，高污染是骨折和骨質疏松癥的重要危險因素，尤其是在低收入人群中，這一現象更為明顯。PM2.5 在體內可激活體內諸如IL-6、IL-1β 和TNF-α 等與絕經后骨質疏松發病有關的炎性因子。多環芳烴作為PM2.5 中的主要成分也會增加維生素D分解代謝［15］。化石燃料燃燒后產生的大量PM2.5 在被吸入人體后，除了會誘導機體產生炎性細胞因子，這些炎性細胞因子可能會直接增加RANKL的分泌，進而誘導骨質疏松的發生［16］。（Osteoprotegerin，OPG）- RANK- RANKL 通路是研究骨質疏松的經典通路。YOUNG 等［17］研究發現，OPG 護骨素能夠與核因子κβ 受體活化因子（receptor activator of NF-κβ，RANK）都 是TNF 超級家庭的成員，對骨質吸收的調節至關重要。RANKL，通過其受體RANK，激活骨質疏松形成，而OPG則是RANKL 的另一個受體，抑制骨質疏松，并通過結合RANKL 抑制骨質流失，以防止RANK 與RANKL 相結合所產生的骨破壞作用。此外，PM2.5 的暴露與維生素D 缺乏有關。流行病學報告［16］顯示，來自污染地區的健康婦女、青少年和兒童血清維生素D 水平較低。PM2.5中的多環芳烴能以受體依賴性方式激活AhR 并加速破骨細胞發育。進而加速體內骨質的吸收［18］。我們前期的實驗結果發現，PM2.5 在絕經后骨質疏松的發生與發展中起到了推動的作用，且PM2.5 的暴露使得絕經后骨質疏松的病理過程產生了更為復雜的變化［1］。

橄欖苦苷是一種多酚類裂環烯醚萜苷類化合物，這是一種廣泛存在于木犀科植物中的成分，具有多種藥理作用，包括：抗氧化作用、抗腫瘤作用、抗炎作用、降血糖作用、降血壓作用、降血脂作用、器官（心臟、肝臟、腎臟）保護作用，以及解毒、抗驚厥、抗焦慮、抗阿爾茲海默癥等藥理作用［5］。橄欖苦苷可以通過降低體內IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎性因子的水平發揮到抗炎的作用［19］，橄欖苦苷可以延緩隨衰老而發生的骨質疏松癥的實驗模型中骨量的損失。體外研究［20］表明，橄欖苦苷抑制從人骨髓分離的間充質干細胞（MSCs）分化為脂肪細胞并增強成成骨細胞的分化，表明它可以預防與年齡相關的骨質流失和骨質疏松癥。在課題組前期的研究［21-23］中發現，橄欖苦苷可有效抑制破骨細胞的增殖，促進成骨細胞的增殖。一項隨機雙盲實驗［24］研究發現，相較于單純服用鈣劑，在服用鈣劑的基礎上加上橄欖提取物可以讓患者的血清骨鈣素上升，腰椎骨密度明顯改善。這可能是因為橄欖苦苷的化學結構中含有一個與雌激素相同的芳香環結構，這使得橄欖苦苷可以競爭性的與雌激素受體結合但不會產生雌激素樣作用［25］。PM2.5 的暴露使得絕經后骨質疏松的發病機制變得越加復雜，橄欖苦苷對于PM2.5 暴露后的絕經后骨質疏松是否仍然有效目前國內外的文獻罕有報道。

國內外指南均將骨密度作為骨質疏松診斷的重要標準之一，測量骨密度一方面可以評估患者的骨折風險，另一方面可以結合患者的臨床表現來推測患者的用藥效果。檢測骨密度的方法多種多樣，目前在臨床和科研中較常采用的是DXA 骨密度測量法［13］。DXA 與其前代產品相比，DXA 的優勢包括減少輻射暴露，更快的掃描采集速度和更高的測量精度。在當前的臨床實踐中，DXA 仍然是評估骨骼健康和身體成分的綜合平臺。因此，DXA 是診斷絕經后骨質疏松癥的所謂金標準［13］。去勢后的SD 雌性大鼠是一種目前已被廣泛使用的研究絕經后骨質疏松的大鼠模型，去勢后大鼠的骨吸收速度快于骨形成，大約在12 周左右可形成骨質疏松［1］。本研究結果發現，氣道滴注PM2.5 混懸液同時橄欖苦苷灌胃處理的去勢雌性大鼠左股骨左股骨干骺端、左股骨中段骨密度高于單純氣道滴注PM2.5 混懸液的去勢雌性大鼠，且橄欖苦苷濃度越高對骨密度的提升越大。因此，橄欖苦苷可以延緩PM2.5 暴露下絕經后骨質疏松的發展，且這一效果與橄欖苦苷的服用劑量存在正相關。猜測橄欖苦苷可能通過抑制體內與骨質流失有關的炎癥反應，降低相關炎癥因子濃度等機制來延緩去勢后雌性大鼠的骨質流失。

絕經后婦女的骨質流失分2 個階段發生。初始短期持續3～5 年，小梁骨質流失迅速發生（更年期相關骨質流失），而后，女性的皮質骨和小梁骨開始流失，這一過程將持續10～20 年（年齡相關性骨質流失）。骨折、殘疾和慢性疼痛是骨質疏松癥最常見的并發癥［6］。PM2.5 暴露不僅與骨質疏松的發病有關［16］，且不同部位的骨質收到影響的程度不一，與小梁部位（即腰椎）相比，皮質部位（即股骨頸）更容易受到PM2.5 暴露造成的不利影響，這可能是由于骨質流失是一個非均勻的過程［15］。大鼠去卵巢后再行PM2.5 懸濁液的暴露，以期能夠盡可能模擬現實場景中PM2.5 暴露后的絕經后女性。本實驗數據表明，橄欖苦苷對于不同部位的骨質的保護作用不同，用藥后股骨干骺端的骨質流失情況要好于股骨中段，且這一效應與橄欖苦苷的服用劑量有關，本實驗中高劑量的橄欖苦苷對骨質的保護作用優于低劑量。根據不同部位的骨礦物鹽數值來看，橄欖苦苷對于保護骨礦物鹽的流失并不明顯且并不能改變不同部位的骨礦物鹽的分布情況。因此，橄欖苦苷能夠延緩PM2.5 暴露后的去卵巢大鼠的骨質的流失，有效提升其骨密度，但是其對骨質保護的具體的機制尚待進一步的研究。

綜上所述，道滴注PM2.5 混懸液并灌胃給予橄欖苦苷的去勢雌性大鼠左股骨左股骨干骺端、左股骨中段骨密度高于單純氣道滴注PM2.5 混懸液的去勢雌性大鼠。且氣道滴注PM2.5 混懸液并灌胃給予橄欖苦苷的去勢雌性大鼠左股骨干骺端的骨質流失情況好于左股骨中段，且100 mg/kg 橄欖苦苷效果更好。但本研究僅限于動物實驗且納入樣本量有限，未能更深入地探討橄欖苦苷的具體作用機制，今后有待于進一步實驗和研究。