單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的應(yīng)用進(jìn)展

沈品，謝芹，楊恩澤，程祥，孫毅

1 無錫市第二人民醫(yī)院急診科，江蘇 無錫 214000；2 昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究院；3 昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院/云南省阜外心血管病醫(yī)院心外科

單個細(xì)胞是最小的功能性生物單位。在細(xì)胞動力學(xué)和獨特的細(xì)胞微環(huán)境共同作用下，即使相同基因型的細(xì)胞也可表現(xiàn)出不同的化學(xué)表型。異質(zhì)性是單個細(xì)胞的固有特征，普遍存在于細(xì)胞系統(tǒng)中，可在生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用［1］。單細(xì)胞基因測序技術(shù)能直觀反映細(xì)胞基因間的差異性，但其仍無法具體闡述細(xì)胞在生物體復(fù)雜環(huán)境中的表型和功能。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)所有功能的直接執(zhí)行者，可提供結(jié)構(gòu)支持、復(fù)制基因組信息、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、控制信號傳導(dǎo)、催化代謝反應(yīng)并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運分子等［2］。因此，對單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的定性和定量分析，是揭示細(xì)胞類型及其狀態(tài)的重要工具，在腫瘤異質(zhì)性、干細(xì)胞分化、生殖細(xì)胞發(fā)育、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)可通過研究單個細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能信息，揭示正常和受損發(fā)育中的細(xì)胞異質(zhì)性［3］。質(zhì)譜技術(shù)［4-6］是目前研究蛋白質(zhì)組學(xué)的一種常規(guī)方法，其檢測蛋白質(zhì)的靈敏度較高［7-9］。基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法能以無偏倚的方式量化單細(xì)胞蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行定性分析，其分析流程包括肽段識別和蛋白質(zhì)推斷、蛋白質(zhì)豐度定量、蛋白質(zhì)生物功能分析等。現(xiàn)將基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的應(yīng)用研究進(jìn)展綜述如下。

1 肽段識別技術(shù)和單細(xì)胞蛋白質(zhì)推斷技術(shù)的應(yīng)用情況

肽段識別和蛋白質(zhì)鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)測序的基礎(chǔ)。從單細(xì)胞質(zhì)譜儀中獲取單細(xì)胞蛋白質(zhì)碎片譜數(shù)據(jù)后，第一個步驟是從單細(xì)胞蛋白質(zhì)裂解質(zhì)譜數(shù)據(jù)中確定肽段的序列［10］。肽段分析方法通過計算機檢索蛋白質(zhì)序列來建立單細(xì)胞蛋白質(zhì)的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫，從單細(xì)胞蛋白質(zhì)目標(biāo)數(shù)據(jù)庫中為檢測得到的單細(xì)胞蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜圖和理論單細(xì)胞蛋白質(zhì)碎片質(zhì)譜圖信息計算一個肽譜匹配分?jǐn)?shù)，最終識別出具有最高匹配分?jǐn)?shù)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)的肽段。

目前臨床常見的可用于肽段識別和蛋白質(zhì)推斷的單細(xì)胞質(zhì)譜分析工具主要有MASCOT 和Andromeda。MASCOT 軟件可將質(zhì)量測量與蛋白質(zhì)序列信息、來自蛋白質(zhì)消化的肽分子量以及串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，生成基于概率的蛋白質(zhì)鑒定評分，進(jìn)行蛋白質(zhì)推斷［11］。SLAVOV 等［12］開發(fā)的基于質(zhì)譜的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析法中，他們在蛋白質(zhì)搜索鑒定流程中使用MASCOT 軟件來鑒定單個細(xì)胞中的數(shù)千種蛋白質(zhì)，并識別不同種類型的癌細(xì)胞，與常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法比較，在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用MASCOT鑒定蛋白質(zhì)的精度高。

Andromeda 是一種使用概率評分模型的新型肽搜索引擎，已廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中［13］。Andromeda 軟件根據(jù)可根據(jù)肽段的敏感度和特異度，判斷目標(biāo)肽段與蛋白質(zhì)。同時，Andromeda的數(shù)據(jù)庫非常大，能以任意高的片段質(zhì)量精度，處理復(fù)雜的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，識別翻譯后修飾的復(fù)雜模式肽段，如高度磷酸化的肽段［14］。

單細(xì)胞質(zhì)譜分析方法有三類，分別是基于毛細(xì)管電泳—質(zhì)譜方法、基于液相色譜—質(zhì)譜方法和無分離手段直接檢測方法。KELLY 等［15］采用液相色譜法來研究單細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)信息，采用Andromeda 引擎在UniProtKB 數(shù)據(jù)庫中搜索譜圖并選擇N 末端蛋白乙酰化和甲硫氨酸氧化作為可變修飾，肽和蛋白質(zhì)均以0.01 的最大錯誤發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行過濾，說明Andromeda 軟件在檢索高度磷酸化的肽段中準(zhǔn)確度更高。ZHU 等［16］在采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)時實用Andromeda 用于數(shù)據(jù)庫搜索和無標(biāo)記蛋白質(zhì)定量，最終運用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示了毛細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)的變化。肽段識別完成后將肽段序列構(gòu)建為原始蛋白質(zhì)，這個過程稱為蛋白質(zhì)推斷。肽段較短時構(gòu)建可靠蛋白質(zhì)具有一定難度，因為一些肽段可能由兩個或多個蛋白質(zhì)共享，因此蛋白質(zhì)推斷過程中常采用概率模型［17］。SCoPE-MS［12］是一種蛋白質(zhì)統(tǒng)計建模框架，可通過定量單個細(xì)胞中的肽段來推斷蛋白質(zhì)，且肽段在單細(xì)胞通道中的檢測強度不受到其在載體細(xì)胞中的豐度影響。

2 單細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度定量技術(shù)的應(yīng)用情況

測定單細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度有助于后續(xù)研究蛋白質(zhì)功能及單個細(xì)胞動態(tài)變化的生長軌跡，探索疾病的發(fā)病機制。單細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度定量可用于計算單細(xì)胞肽段及蛋白具體含量。目前多數(shù)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究均使用有標(biāo)定量法進(jìn)行蛋白質(zhì)豐度定量。有標(biāo)定量法是一種在樣本里混入同位素標(biāo)記物，利用同位素標(biāo)記物來定量單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的方法。有標(biāo)定量法的應(yīng)用成本較高，但其對低豐度蛋白質(zhì)的檢測效率和單細(xì)胞蛋白質(zhì)定量的準(zhǔn)確性均較高。同時，有標(biāo)定量法可以量化每個細(xì)胞中每個標(biāo)簽標(biāo)記肽段水平，同時從所有細(xì)胞中匯集的總肽量識別其序列。

基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定量蛋白質(zhì)分析軟件主要是MaxQuant。MaxQuant 采用MASCOT 作為搜索引擎，與主流的質(zhì)譜平臺結(jié)合使用［18］。MaxQuant 在Max-LFQ模式下的定量完整蛋白質(zhì)組和低豐度蛋白質(zhì)組的準(zhǔn)確性和精密度均優(yōu)于其他方法［19］。BANEK等［20］在對卵裂期青蛙胚胎的各個胚胎細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量時，使用毛細(xì)管電泳電噴霧電離高分辨率質(zhì)譜技術(shù)后，使用MaxQuant來處理原始數(shù)據(jù)。

3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)生物學(xué)功能分析技術(shù)的應(yīng)用情況

單細(xì)胞蛋白質(zhì)功能分析，需要首先進(jìn)行蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，后進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作用網(wǎng)絡(luò)。

3.1 單細(xì)胞蛋白質(zhì)的定量 蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)清理、過濾和標(biāo)準(zhǔn)化過程，就可以進(jìn)行后續(xù)差異表達(dá)蛋白的統(tǒng)計分析。比較分析不同狀態(tài)下單細(xì)胞蛋白質(zhì)的差異性是單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵步驟，可運用不同的方法［21-24］尋找差異蛋白。Slavov 團隊開發(fā)了一個原則性的貝葉斯框架［21］，在確定肽序列時納入肽的保留時間信息，對數(shù)據(jù)驅(qū)動的保留時間比對以進(jìn)行識別。數(shù)據(jù)驅(qū)動的識別保留時間比對可以用于多數(shù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，并且這個框架應(yīng)用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)時非常有效，它可以在錯誤發(fā)現(xiàn)率為1%的情況下將確信識別的多肽數(shù)量增加50%［22］。

為優(yōu)化單細(xì)胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)，HUFFMAN 等［25］基于質(zhì)譜交互式可視化和分析開發(fā)得到數(shù)據(jù)驅(qū)動質(zhì)譜優(yōu)化平臺（DO-MS），可用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的檢索和分析，后續(xù)還將進(jìn)一步分析并量化哺乳動物中的單細(xì)胞蛋白質(zhì)及其所有修飾［26］。

3.2 單細(xì)胞蛋白質(zhì)的功能富集分析 基因本體論（Gene Ontology，GO）富集是富集分析中使用最廣泛的一個技術(shù)［27］。GO有三個主要類別，即：生物過程、分子功能、細(xì)胞成分。GO富集分析的常用數(shù)據(jù)庫有Amigo 、DAVID［28］、STRING［29］。LI 等［30］新開發(fā)了一個基于質(zhì)譜的單細(xì)胞蛋白分析軟件，可用于分析單細(xì)胞生物的各種細(xì)胞，監(jiān)測響應(yīng)受擾動的細(xì)胞培養(yǎng)條件的代謝變化，利用萊茵衣藻來研究植物特異性生物過程，如植物光合作用及在極端條件下生物的生長過程。

京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析方法可用于分析各種生物通路［31］。生物通路用來描述生物過程中的細(xì)胞內(nèi)分子之間的生物作用和化學(xué)反應(yīng)。蛋白質(zhì)集富集分析（Protein Set Enrichment Analysis，PSEA）源自基因集富集分析（Gene Set Enrichment，GSEA）。在PSEA 中，富集分?jǐn)?shù)是根據(jù)加權(quán)運行總和統(tǒng)計計算的，而豐度沒有顯著變化的蛋白質(zhì)可能會對富集分?jǐn)?shù)產(chǎn)生負(fù)面影響。PSEA-Quant 是專門為蛋白質(zhì)定量數(shù)據(jù)開發(fā)的，可以為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供更方便和更可靠的分析流程。Slavov［12］課題組為比較單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法在不同功能的基因之間的一致性，對找出的單細(xì)胞蛋白進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蛋白水解和發(fā)育中起作用的基因在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的一致性顯著低于所有基因，這種差異可能反映了不同基因組的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或測量噪點的差異。才能提高功能富集分析的準(zhǔn)確性。

3.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 當(dāng)前，基于蛋白質(zhì)組學(xué)的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)主要有兩個類別：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)和信號網(wǎng)絡(luò)。PPI 網(wǎng)絡(luò)描述了兩種蛋白質(zhì)之間的直接相互作用。 許多生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫如STRING、HPRD［32］、MINT［33］，BioGRID［34］和PIPs 等為PPI 數(shù)據(jù)庫，信號通路數(shù)據(jù)庫有KEGG、Reactome［35］、Pathway Commons［36］。Perseus 用于分析和可視化基于質(zhì)譜定量的MaxQuant 數(shù)據(jù)［24］，可進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)矩陣、結(jié)果圖、各種質(zhì)量控制圖以及通路-基因本體富集分析。

綜上所述，基于質(zhì)譜的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法主要有肽段識別和蛋白質(zhì)推斷、單細(xì)胞蛋白質(zhì)豐度定量、單細(xì)胞蛋白質(zhì)生物功能分析等。肽段與蛋白質(zhì)識別主要采用MASCOT 和Andromeda 等軟件，可從質(zhì)譜儀獲取的單細(xì)胞蛋白裂解質(zhì)譜數(shù)據(jù)中鑒定肽段序列。MaxQuant 等蛋白質(zhì)豐度定量軟件可計算出細(xì)胞中的肽段及蛋白的具體含量；生物信息學(xué)分析中主要應(yīng)用Perseus 等軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)功能富集分析及蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。目前單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法的研究正處于新興階段，更多研究方法正在深入開發(fā)。