結直腸癌的關鍵癌癥驅動基因篩選及其生物學功能分析

王錦淼，王穎，周博昊，王雷，穆偉斌

1 齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161003；2 常熟理工學院計算機科學與工程學院

癌癥已經成為全球主要死亡原因之一［1-2］。癌癥是一種由體細胞突變和克隆選擇導致的細胞惡性增殖的基因疾病，可直接導致癌癥發生的基突變即為“驅動突變”［3］，而不會造成癌細胞增殖的無直接影響基突變則為“乘客突變”，“乘客突變”對癌癥的驅動作用很小［4］，因此，識別出對癌癥具有重要影響的“驅動基因”是目前癌癥發生機制的研究重點［5-6］，包含驅動突變的基因則為“癌癥驅動基因（Cancer Driver Genes，CDGs）”。CDGs可為癌癥預防、診斷和精準治療提供關鍵信息［7］。結直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年上升［8］。CRC 的發病與多種因素相關，隨著高通量測序技術的進展，多組學基因檢測技術得到快速發展，但檢測常產生成千上萬CRC 相關基因，無法識別CRC的CDGs［9-11］。2021年6月起，我們采用多組學數據的組合優化方法，篩選CRC 的關鍵癌癥驅動基因（Cancer Driver Genes，CDGs），并分析其生物學功能。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 CRC 基因數據和基因表達數據的下載及預處理 從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//cancergenome. nih. gov/）中搜索并下載CRC 基因［13］，一共獲得612 份樣本轉錄組分析數據，其中CRC 患者568 例、正常人44 例，癌基因56 753 個。從國際腫瘤基因組協作組數據庫

（the International Cancer Genome Consortium，ICGC）

（https：//dcc. icgc. org/）中搜索并下載CRC 基因表達數據［14］，一共獲得548 份數據，癌基因20 888 個。對下載的數據庫數據進行質量控制，對實驗數據進行預處理，剔除異常值數據，去除信息不全、重復和可能存在錯誤的樣本和突變頻率過高或過低基因［15］，提高數據可靠性、準確性。

1.2 CRC的關鍵癌癥驅動基因篩選

1.2.1 構建CRC 基因突變矩陣與CRC 突變基因表達矩陣 從基因芯片中提取出樣本原始突變基因和表達基因，運用“python”軟件將數據整理為基因-樣本形式的矩陣，將其分為癌癥組和對照組，將CRC突變基因數據整理成突變矩陣（CRC 基因突變矩陣），將突變基因表達數據構建成基因表達矩陣（CRC突變基因表達）。

1.2.2 構建CRC 高維突變基因加權網絡模型 從STRING 數據庫（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）［17］中獲取CRC 基因的蛋白質相互作用（PPI）網絡，運用python 軟件將CRC 基因突變矩陣、CRC突變基因表達矩陣和PPI數據整合交集，以突變基因和PPI 網絡的score 值分別作為節點和邊，score值代表了基因之間這種相互作用（既包括蛋白質之間直接的物理的相互作用，也包括蛋白質間連接功能的相關性），節點屬性為突變因子分數，兩者結合建立高維突變基因加權網絡，共包含14 388個基因。

1.2.3 CRC 癌癥驅動基因篩選 根據高維突變基因加權網絡模型的結構特征，通過每個基因在網絡中相鄰基因的突變影響，計算最大基因影響分數，基因節點影響分數最大值即基因最大突變影響分數得分，根據基因最大突變影響分數得分最終得到CRC癌癥驅動基因。

1.2.4 CRC 關鍵癌癥驅動基因篩選 CGC（The Cancer Gene Census）［19］數據庫的網址為：https：//cancer. sanger. ac. uk/census，其收錄基因是已被醫學界和生物界所認定與癌癥相關的驅動基因。從CGC 數據中提取已經證實的結直腸癌癥基因［20-21］與“1.2.3”得到CRC 癌癥驅動基因比較，得到CRC 關鍵癌癥驅動基因。

1.3 CRC 關鍵癌癥驅動基因的生物學功能分析 采用STRING（https：//string-db. org）數據庫構建CRC 關鍵癌癥驅動基因的蛋白質相互作用網絡（PPI），互動分數設置為中等置信度0.4 分，該圖由節點和邊組成，節點代表蛋白，邊代表關系，不同的顏色代表不同的數據來源。利用STRING在線分析工具生物注釋將排名前100的顯著差異基因進行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析。GO 功能富集分析是對基因進行注釋和生物學功能分析的重要工具，Go 功能主要分成三大類：生物學過程（BP）、分子功能（MF）和CC細胞組成（CC），KEGG 信號通路富集分析可從大規模分子數據集中了解基因的富集通路。

2 結果

2.1 CRC 關鍵癌癥驅動基因 最終篩選出22 個CRC關鍵癌癥驅動基因，其中排名前20分別為ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C、BRAF、BMPR1A、PCDHGA8、PCDHGA5、FAT4、PCDHA8、APC、PCDHGA7、PCDHA10、PCDHA9 及FBXW7。基因最大突變影響分數得分分別為37 146.55、37 146.55、34 319.47、33 546.18、33 546.18、32 235.49、32 008.97、31 207.03、30 492.44、30 362.73、30 340.14、29 289.54、29 289.54、28 121.02、26 733.33、23 042.20、21 811.26、20 764.04、20 764.04、20 394.35。CRC 關鍵癌癥驅動基因的相互作用圖見圖1。

圖1 CRC關鍵癌癥驅動基因的相互作用圖

2.2 CRC 關鍵癌癥驅動基因的生物學功能 CRC關鍵癌癥驅動基因的PPI 網絡包含100 個節點，241條邊，平均節點度為4.82，局部聚類系數為0.474，PPI 富集P值＜1.0e-16。GO 功能富集結果顯示，CRC 關鍵癌癥驅動基因的分子功能主要集中在鈣離子結合、陽離子結合、金屬離子結合、離子結合、捆綁、β-連環蛋白結合、組蛋白甲基轉移酶活性（h3-k4特異性）等；生物過程主要集中在通過質膜黏附分子的同源性細胞黏附、通過質膜黏附分子的細胞-細胞黏附、細胞黏附、細胞間黏附、神經系統發育、解剖結構發展、心臟發育、系統開發、多細胞生物發育、解剖結構形態發生等；細胞組成主要集中在質膜、質膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節、膜的組成部分、質膜有界細胞投射、肌原纖維附著點、超分子纖維等。

KEEG 信號通路富集分析結果發現，CRC 關鍵癌癥驅動基因的信號通路主要集中在大腸癌、子宮內膜癌、肝細胞癌、慢性粒細胞白血病、FoxO 信號通路、調節干細胞多能性的信號通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA。

3 討論

癌癥的發生和發展與基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、表觀組學及代謝組學等多組學數據息息相關［12］。以往通常是在單個的大樣本數據中找到一些突變率顯著很高的基因作為候選基因，這樣的篩選造成癌癥通路中存在基因之間強異質性的問題，所以如果單純的對其中一種組學數據來進行數據挖掘和生物研究會存在明顯的不足與缺陷，那么通過整合多組學數據并進行綜合分析對癌癥得到了更深層次和更全面的探索，利用生物信息學技術鑒定出關鍵基因及其相關通路，從病理發生的分子機制角度對CRC 進行理解，找到潛在可深入研究的用于診斷生物標志物以及治療CRC的分子八項標志物。

本研究采用多組學數據的組合優化方法，整合體細胞突變數據、基因表達數據以及蛋白質相互作用網絡三種組學數據。首先基于多統計學方法的CDGs生物特征提取，計算基因突變因子和皮爾遜相關系數，分別構建出突變矩陣和基因表達矩陣。然后以基因的突變頻率和基因表達水平相關性為節點和邊，建立高維突變基因加權網絡模型，基于該網絡模型利用重力學模型計算基因與鄰居節點的突變影響分數，根據節點的影響分數最大值進而得出基因的突變影響因子大小，并在兼顧基因網絡結構的條件下，以突變影響因子大小為根據運用一種綜合的基因打分方法，最終得出驅動基因的預測集。

本研究中構建的基因相互作用網絡信息更加全面，對于以往單一組學數據研究的缺陷進行了彌補，在多個體細胞突變數據集上進行評估，優先選擇潛在的癌癥驅動基因，對識別出的驅動基因進行CGC富集對比分析并能很好富集到CGC 列表中，利用本方法識別出的CRC排名靠前出現在CGC基因列表中的 前10 個 包 括：ATM、TTN、PCDHGB3、LRP1B、PCDHA6、PIK3CA、SYNE1、PCDHGB2、KMT2C 和BRAF，在CRC 組織中均明顯表達增高，說明了這10個基因均與癌細胞的發生發展密切相關，這些關鍵基因可以作為CRC診斷和治療的潛在靶標，也使我們更加全面的了解CRC的發病機制和發展機理，對于CRC的預防和早期診斷、治療具有重要的臨床意義。

對CRC 的關鍵癌癥驅動基因進行GO 本體論分析和KEGG 通路生物功能分析，結果發現，CRC關鍵癌癥驅動基因的分子功能主要集中在鈣離子結合、陽離子結合、金屬離子結合、離子結合、捆綁、β-連環蛋白結合、組蛋白甲基轉移酶活性（h3-k4 特異性）等；生物過程主要集中在通過質膜黏附分子的同源性細胞黏附、通過質膜黏附分子的細胞-細胞黏附、細胞黏附、細胞間黏附、神經系統發育、解剖結構發展、心臟發育、系統開發、多細胞生物發育、解剖結構形態發生等；細胞組成主要集中在質膜、質膜的組成部分、膜、肌原纖維、肌膜、肌節、膜的組成部分、質膜有界細胞投射、肌原纖維附著點、超分子纖維等。驅動基因都是與質膜、肌膜和離子結合炎癥等生命正常運行時有密切關聯的，說明這些驅動基因具有重要的生物學功能。對KEGG 信號通路與關鍵基因關聯的分析，本研究中CRC 關鍵癌癥驅動基因的信號通路主要集中在大腸癌、子宮內膜癌、肝細胞癌、慢性粒細胞白血病、FoxO信號通路、調節干細胞多能性的信號通路、胃癌、前列腺癌、乙型肝炎、癌癥中的微小RNA，說明CRC 關鍵基因的基因調控通路可能導致癌癥的發生發展，同時同一驅動基因在不同腫瘤之間產生致癌作用，說明癌癥的發病存在共通之處。

綜上所述，成功篩選出22個CRC關鍵癌癥驅動基因，如ATM、TTN、PCDHGB3等。CRC 關鍵癌癥驅動基因的分子功能主要集中在鈣離子結合、陽離子結合、金屬離子結合等；生物過程主要集中在通過質膜黏附分子的同源性細胞黏附、通過質膜黏附分子的細胞-細胞黏附、細胞黏附等；細胞組成主要集中在質膜、質膜的組成部分、膜等；信號通路主要集中在大腸癌、FoxO 信號通路、調節干細胞多能性的信號通路等。深入了解CRC 關鍵癌癥驅動基因有助于研究CRC 發生發展機制，同時可為CRC 提供新的治療靶點。同時，多組學數據分析方法能夠高精度預測疾病的驅動基因，為其他癌癥的診療研究提供了一種新方法。