微殘清顆粒含藥血清對CD34+CD38-KG1a 細胞增殖凋亡的影響及其作用機制

閆理想，姜靜，楊向東，何敬，楊曦，陳海靜，李德冠，史哲新

1 天津中醫藥大學第一附屬醫院血液科國家中醫針灸臨床醫學研究中心，300381 天津；2 天津市中醫藥研究院附屬醫院消化二科；3 中國醫學科學院放射醫學研究所

白血病干細胞（Leukemia stem cells，LSC）可能在白血病的發生、發展中發揮重要作用，與白血病的復發及多藥耐藥有關［1-2］。消除LSC 或逆轉LSC細胞耐藥有助于提高白血病療效。LSC 細胞多藥耐藥不僅與Wnt、PI3K/AKt 等信號通路的表達異常有關，還與多藥耐藥負調控因子的活性降低或缺失有關，如Ⅰ型跨膜糖蛋白（CD95）［3］、拓撲異構酶Ⅱα（TOPOⅡα）［4］及人第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）［5］缺失或表達下調等。中醫理論認為，白血病是正氣虛損、內邪滋生、邪毒內侵導致的，其治療以扶正解毒為原則。基于白血病復發耐藥發病機制及治療原則，我科在當歸補血湯、四君子湯及青黃散等經典方劑基礎上，結合多年臨床實踐總結出微殘清顆粒方劑。我們前期研究［6］發現，微殘清顆粒輔助治療可提高難治性急性白血病患者的臨床療效，一定程度逆轉LSC細胞的耐藥，但其具體作用機制尚不明確。我們觀察了微殘清顆粒含藥血清與柔紅霉素共培養對耐藥白血病細胞（CD34+CD38-KG1a 細胞）增殖、細胞周期及凋亡情況的影響，并探討其可能作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、試劑及儀器 人急性骨髓白血病KG1a細胞株由中國醫學科學院血液病研究所饋贈。20只SPF級新西蘭大白兔（6月齡），雌雄各10只，體質量2.5～3.0 kg，購于北京華阜康公司（SCXK（京）2014-0004）。飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物房，適應性飼養1 周。注射液鹽酸柔紅霉素（20 mg，15049039）購自美國輝瑞；微殘清顆粒（黃芪30 g，當歸15 g，全蝎9 g，青黛9 g，雄黃0.3 g，人參10 g，白術15 g，茯苓15g，甘草10 g）由我院中藥制劑實驗室采用單藥顆粒制備技術制備而成，無菌干燥后密封于塑封袋中備用，應用時滅菌注射用水配置成1 g/mL 沖劑，105 ℃蒸汽滅菌。實時定量PCR 儀（CFX96，美國Bio-rad）、流式細胞儀（C6 型，美國BD）；熒光成像系統（ChemiDoc MP，Bio-rad）。CD34、CD38 磁珠（130-046-702，130-092-263，Miltenyi Biotec）；CCK-8 試劑盒（40203ES60，上海前塵生物）；CD95、PTEN、TOPO Ⅱα 抗 體（sc-8009、sc-165986、sc-133197，Santa Cruz）；羊抗兔IgG 抗體（CW0103S，北京康為世紀）；RNA、cDNA 提取試劑（CW0597、CW0741A，北京康為世紀；PCR 試劑盒（PR7012，北京百泰克生物）。

1.2 CD34+CD38-KG1a 細胞培養、分選、微殘清顆粒含藥血清培養方法

1.2.1 CD34+CD38-KG1a 細胞分選 KG1a 細胞常規培養于含柔紅霉素（1ug/ml）的培養液中，以保持其耐藥性。取對數生長期KG1a 細胞，采用免疫磁珠法分選CD34+CD38-KG1a 細胞，所有操作均嚴格按試劑使用說明書操作。采用流式細胞術檢測分選前后CD34+CD38-KG1a 細胞亞群比例，分選前后CD34+CD38-KG1a細胞比例分別為45.6%±4.36%、97.2%±2.53%，分選后CD34+CD38-KG1a細胞比例達到95%以上，符合后續實驗要求。

1.2.2 微殘清顆粒含藥血清制備 20 只大白兔隨機分為中藥組和空白組，每組各10 只。根據黃繼漢［7］人鼠劑量換算方法，中藥組給予微殘清顆粒水煎劑8 mL（1 g/mL）灌胃，2 次/日，連續灌胃7 d；空白組予0.9%生理鹽水8 mL 灌胃，時間頻率同中藥組。灌胃第7 天末次給藥2 h 心臟取血5 mL。常規離心分離血清，同組兔混勻后過濾分裝，備用。

1.2.3 細胞分組及微殘清顆粒含藥血清培養方法 取4×104/mL 的CD34+CD38-KG1a 細胞分為A、B、C、D 組，接種于96 孔板，每孔100 μL，每組5 個復孔。A 組用微殘清顆粒含藥血清（血清為終體積20%）+柔紅霉素1.25 μg/mL［8］培養，B 組加入微殘清顆粒含藥血清（血清為終體積20%）培養，C 組加入1.25 μg/mL 的柔紅霉素培養，D 組為空白對照組，加入正常細胞培養液培養。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 分別于培養24、48、72 h 時，向各組培養板每孔中加入8 μL CCK8 溶液，然后常溫培養箱內孵育1 h后，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值所有操作均嚴格按照說明書進行。測算各組細胞增殖抑制率，細胞增生抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。重復3 次取平均值。

1.4 各組細胞周期、細胞凋亡及CD95 表達觀察 培養72 h時取各組細胞，離心5 min，PBS清洗2次，調節細胞濃度為5×105/mL，加入-20 ℃預冷70%乙醇2 mL 固定，RNase 消化，4 ℃放置24 h，PBS 洗2次，每管加入PI（50 μg/mL）1 mL，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期，AUXIN-V 法測算各組細胞凋亡率（早期細胞凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率）。另取培養72 h 各組細胞，2 000 r/min 離心5 min 去上清，避光分別加入CD95 抗體5 μL，同時設空白對照，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min，1 mL PBS 混勻、離心后棄上清，加入50 μL PBS 混勻，上機測算CD95陽性比例。實驗均重復測算3次，取平均值。

1.5 各組細胞TOPOⅡα、PTEN mRNA 及蛋白檢測 ①采用RT-PCR 法檢測各組細胞TOPOⅡα、PTEN mRNA：培養72 h 時取各組細胞，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，所有操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。RT- PCR 反應細胞TOPOⅡα、PTEN mRNA，引物序列由上海生工公司合成。β-actin（上游引物：5，-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3，，下游引物5，- AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3，）、PTEN（上游引物5，-ACCAGGACCAGAGGAAACCT-3，，下游引物 5，-GCTAGCCTCTGGATTTGACG-3，）、TOPO Ⅱα（上游引物：5，-GCCCTCCTGCTACACATTTC-3，，下游引物5，-AACACTTGGGCTTTACTTCACTT-3，）。以2-ΔΔCt代表目的基因的相對表達量，重復檢測3 次取平均值。②采用WESTERN Blotting 檢測各組細胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白：培養72 h 時取各組細胞混勻，PBS（0.01 mol/L，pH 7.0～7.2）沖洗3 次，加1 mL 液氮研磨，200 μL 蛋白裂解液混勻，4 ℃搖晃震蕩10 min，冰上裂解30 min，離心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清總蛋白。采用BCA法檢測蛋白，變性、離心（10 000 r/min，常溫，30 s），取上清進行SDS-PAGE，所有操作均嚴格按照試劑說明書操作。應用Image Lab 4.0 軟件，以D 組為基量（相對定量為1），測算各組細胞TOPOⅡα、PTEN 蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據處理。采用P-P 圖檢驗數據的正態性，符合正態分布的計量數據以±s表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 培養24、48、72 h 時各組細胞增殖抑制率比較 培養24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 培養24、48、72 h時各組細胞增殖抑制率比較（%，-x±s）

2.2 培養72 h 時各組細胞周期比例比較 培養72 h時各組細胞周期比例比較見表2。

表2 培養72 h時各組細胞周期比例比較（%，±s）

表2 培養72 h時各組細胞周期比例比較（%，±s）

注：與D組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組G2/M 17.90±1.10*△18.80±2.74*△10.25±2.11 10.75±1.02 G0/G1 66.35±2.34*△65.19±3.48*△77.51±2.20 74.87±1.64 S 15.74±1.46 16.00±2.06 12.23±0.60 14.77±1.91

2.3 培養72 h時各組細胞凋亡率比較 培養72 h時各組細胞凋亡率比較見表3。WCQ 組、WCQ+DNR組的早期凋亡明顯升高，在晚期凋亡上僅有WCQ+DNR組的比例明顯升高，差異具有統計學意義。

表3 培養72 h時各組細胞凋亡率比較（%，±s）

表3 培養72 h時各組細胞凋亡率比較（%，±s）

注：與B組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.052.4 培養72 h時

組別A組B組C組D組細胞凋亡率晚期凋亡率28.95±1.66*10.85±0.82△14.13±1.86 14.56±1.69總凋亡率55.24±2.71*31.23±2.36 26.11±2.38 27.25±1.36早期凋亡率29.29±1.88*20.34±1.49△10.18±0.97 11.59±1.94

2.4 各組CD95 陽性細胞比例比較 培養72 h 時A、B、C、D 組CD95 陽性細胞比例 分別為16.50% ±2.62%、9.60% ± 1.73%、5.00% ± 3.06%、7.70% ±2.51%，與B、C、D 組比較，A 組CD95 陽性細胞比例高（P均＜0.05）。

2.5 培養72 h 時各組細胞PTEN、TOPOⅡα mRNA相對表達量比較 培養48 h 時A、B、C、組細胞PTEN mRNA 相 對 表 達 量 分 別 為27.34 ± 4.16、7.52 ± 2.48、1.87 ± 0.69，與D 組 比 較，A、B 組PTEN mRNA 相對表達量升高（P 均＜0.05），與C 組比較，A、B 組PTEN mRNA 相對表達量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα mRNA 相對表達量分別為12.74±2.53、1.08±1.16、0.75±0.62，與C、D組比較，A組TOPOⅡα mRNA相對表達量升高（P均＜0.05）。

2.6 培養72 h 時各組細胞PTEN、TOPOⅡα 蛋白相對表達量比較 培養48 h 時A、B、C、組細胞PTEN蛋白相對表達量分別為2.3 ± 0.41、1.99 ± 0.27、0.92±0.26，與D 組比較，A、B 組PTEN 蛋白相對表達量升高，與C 組比較，A、B 組PTEN 蛋白相對表達量升高（P 均＜0.05）；TOPOⅡα 蛋白相對表達量分別為1.68±0.16、1.47±0.53、0.61±0.19，與D 組比較，A 組TOPO Ⅱα 蛋白相對表達量升高（P＜0.05），與C 組比較，A、B 組TOPOⅡα 蛋白相對表達量升高（P均＜0.05）。

3 討論

LSC 多藥耐藥是白血病復發難治的根源，盡管其發生的機制是復雜多樣的，但不外乎正調控與負調控兩方面，其中負調控蛋白CD95、負調控酶TopoⅡα和負調控基因PTEN 是近年來研究的熱點，這些負調控因子的活性降低或缺失與LSC多藥耐藥的發生有著密切的關系。負調控蛋白CD95（又稱Fas，Apo-1）是細胞表面膜蛋白受體分子，分子量48ku，CD95 與其天然配體（FasL）結合后可向敏感靶細胞內傳遞死亡信號而誘導凋亡。近年研究已證實，多藥耐藥病人CD95低表達或活性降低，通過Fas/FasL凋亡途徑參與LSC 多藥耐藥［9］。負調控酶TopoⅡα是蒽環類化療藥物作用靶點，蒽環類藥物和TopoⅡα 結合，抑制DNA 再連接，阻止細胞復制，TopoⅡα 高表達有利于蒽環類藥物敏感，相反多藥耐藥的LSC低表達TopoⅡα，提高TopoⅡα表達及活性就是增強拓撲異構酶抑制劑作用效果［10］。研究發現，TopoⅡα 的高表達可提高化療病理反應性［11］。負調控基因PTEN 在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤等中存在不同程度的低表達或雜合性缺失［12-13］，研究證實PI3K/Akt/mTOR 通路的活化與PTEN 的低表達或缺失相關，而該通路為細胞凋亡、耐藥的重要通路［14］。

基于白血病復發“髓虛邪伏，邪毒致變”的機制，治則當以益氣養陰以扶正，解毒以祛邪，本課題組根據這一中醫病理變化提出益氣養陰解毒法。經多年臨床實踐，證實該治法在復發難治白血病的治療中具有較好的臨床效果，該治法選用經典方劑當歸補血湯、四君子湯合青黃散加減共奏益氣養陰解毒之功，方藥選用黃芪、當歸益氣養血為君，全蝎、青黛、雄黃解毒攻毒為臣，人參、白術、茯苓、甘草益氣健脾為佐使，全方攻補兼施，顧護正氣，驅邪不傷正，扶正不留邪。我們前期研究發現，常規化療配合微殘清顆粒藥可提高難治性急性白血病患者的臨床療效，推測微殘清顆粒可能具有增加患者對常規化療藥的敏感性，具有逆轉難治性急性白血病耐藥的作用，但其作用機制尚不清楚［6］。我們的研究發現，與空白組比較，微殘清顆粒含藥血清單獨培養時對耐藥CD34+CD38-KG1a 并未表現出明顯的抑制作用，而單獨柔紅霉素組的抑制率亦低于微殘清含藥血清聯合柔紅霉素組，結果表明微殘清顆粒單獨用藥抗白血病耐藥效果不顯著，而與柔紅霉素聯合應用后細胞增殖明顯抑制，提示微殘清顆粒可能具有逆轉耐藥的作用，從而增加白血病干細胞對化療藥物的敏感性。進一步研究發現，微殘清顆粒組和微殘清顆粒聯合柔紅霉素組均可促進CD34+CD38-KG1a 細胞進入細胞周期及凋亡，尤其表現在早期凋亡上，提示微殘清顆粒逆轉耐藥的途徑可能是促進KG1a 干細胞進入細胞周期，增加分化凋亡，進而增強DNR 對KG1a干細胞的抑制作用。同時我們發現，微殘清顆粒可提高KG1a 干細胞膜蛋白CD95 的表達，在聯合DNR 時可提高TOPOⅡα、PTEN 蛋白及mRNA 的表達，單獨微殘清顆粒僅可提高PTEN mRNA，對TOPOⅡα mRNA 未見明顯干預作用，提示微殘清顆粒具有逆轉LSC耐藥作用的機制可能是通過調控膜蛋 白CD95、TOPO Ⅱα、PTEN 耐 藥 負 調 控 因 子 而實現。

綜上所述，加入微殘清顆粒含藥血清與柔紅霉素可抑制CD34+CD38-KG1a 細胞的增殖、降低G0/G1期細胞比例、增加G2/M期細胞比例，促進細胞凋亡，其可能機制為微殘清顆粒含藥血清可提高CD34+CD38-KG1a 細胞CD95 的陽性比例、促進細胞PTEN、TOPOⅡαmRNA 及蛋白表達。微殘清顆粒含藥血清可增加KG1a 干細胞對柔紅霉素的藥物敏感性，其機制可能是微殘清顆粒通過活化CD95、PTEN及TOPOⅡα 負調控因子影響KG1a干細胞的細胞周期及凋亡。但LSC 細胞的多藥耐藥機制復雜，涉及蛋白磷酸化、基因甲基化等諸多調控因子的干預，而微殘清顆粒的效成分及具體藥理作用后續仍需進一步深入研究探討。