基于rbcL序列對貓人參及其近緣種的分子鑒定研究

張曉芹，毛佳樂，王慧玉，雷后興，藍 艷

（浙江中醫藥大學附屬麗水中醫院，浙江 麗水 323000）

貓人參為獼猴桃科植物對萼獼猴桃（鑷合獼猴桃）（Actinidia valvataDunn.）或大籽獼猴桃（Actinidia macrospermaC.F.Liang）的干燥根及粗莖，收載于2015年版《浙江省中藥炮制規范》，具有解毒消腫、祛風濕的功效，臨床常用于深部膿腫、骨髓炎、風濕痹痛、瘡瘍腫毒等疾病［1］。藥理研究表明，貓人參對胃癌［2-3］、肝癌［4］、肺癌［5］等具有較好療效，臨床應用廣泛。

近年來，隨著野生貓人參的不斷消耗，貓人參資源日益短缺，市場上貓人參混偽品開始出現，以其近緣種較為多見。調研發現市場上常用作貓人參使用的還有黑蕊獼猴桃（Actinidia melanandraFranch.）及中華獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch.）。對萼獼猴桃、大籽獼猴桃、黑蕊獼猴桃為獼猴桃屬凈果組植物，中華獼猴桃為獼猴桃屬星毛組植物，雖然其親緣關系較近，然而在藥理活性上具有較大差異。體外抗腫瘤活性研究表明，對萼獼猴桃和大籽獼猴桃對于胃癌和肺癌具有較好的抑制作用，而黑蕊獼猴桃和中華獼猴桃抑制效果較差［6-8］。因此在臨床應用中，應將貓人參與其混偽品進行區分。

有學者基于性狀鑒定對貓人參及其近緣種進行了鑒定，認為草酸鈣結晶（皮部有亮星）、紫色斑（貓爪印）及根據貓是否愛吃等特點可對貓人參進行物種鑒定［9］，然而該方法依靠經驗性較強，且同屬其他物種植物也多有此類特征；另有學者采用熒光、紫外、紅外、指紋圖譜等方法對貓人參及其近緣種進行鑒定［8，10］，但前處理復雜，需要根據貓人參不 同極性提取物分類鑒定，鑒定結果依靠檢索表確認，耗時較長；基于脫氧核糖核酸（DNA）條形碼的獼猴桃屬系統發育學分析表明，獼猴桃屬植物可根據其基因序列進行初步區分，然而前期主要對其屬內不同亞組的劃分規律進行了研究［11］，尚缺乏對貓人參的物種鑒定分析。

葉綠體核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶基因（rbcL）序列具有易擴增、保守性強、單性遺傳、進化路線獨立等優點，被廣泛應用于藥用植物的分子鑒定及系統發育學研究，對于種間植物具有較好的鑒定優勢［12-13］。綜上，本研究基于rbcL序列對貓人參及其近緣種進行鑒定研究，以期為貓人參的用藥安全及質量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

微量移液器（德國Eppendorf公司），2-16R離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司），BIO-RAD T100聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）儀（美國伯樂公司），JY-SP型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），NanoDropOne微量核酸定量儀（美國Thermo公司），GenoSens1850凝膠成像分析系統（上海勤翔科學儀器有限公司），IMS-50全自動雪花制冰機（常熟市雪科電器有限公司）。

1.2 試劑

Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、Taq酶、DNA分子量標準標記物（Marker）（100～2000 bp）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（5 mmol/L）、5×PCR Buffer、氯化鎂（MgCl2）（25 mmol/L）、瓊脂糖均購自上海生工生物工程股份有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用試劑均為分析純。

1.3 材料

同科水東哥屬植物水東哥（Saurauia tristylaDC.）的基因序列下載自美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫，另外9種獼猴桃屬植物為野外采集獲得的樣品，共計110份，分別來源于浙江麗水市、福建省南平市共計11個采樣地點，每個采樣點采集葉片10份用于基因序列測定；其余35條用于分析的基因序列下載自NCBI數據庫（Genbank）。野外采集樣品經麗水市中醫院主任中藥師林娜鑒定為相應獼猴桃屬植物。見表1。

2 方法

2.1 DNA提取

取各樣品的新鮮葉片約20 mg，經液氮研磨粉碎后，根據Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒使用說明提取DNA，微量核酸定量儀檢測所得DNA質量。

2.2 PCR擴增

PCR擴增引物序列為r-F：5′-ATGTCACCACAA ACAGAGACTAAAGC-3′，r-R：5′-GTAAAATCAAGTC CACCRCG-3′。采用50 μL反應體系：5×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，MgCl24 μL，引物各2 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。

PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環數35；72℃延伸10 min。

2.3 測序分析

擴增產物經1.00%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢驗。PCR產物由上海生工生物工程有限公司進行測序分析。每個樣品均采用正反雙向測序。

2.4 序列比對及ML系統聚類樹的建立

DNA序列采用ContingExpress及DNAman軟件進行拼接及序列比對，采用Editseq及MEGA-X軟件對序列長度、變異位點、保守位點以及堿基組成進行分析，并計算種間及種內遺傳距離，構建ML系統聚類樹。DNA二級結構采用DNAman軟件生成。

3 結果

3.1 rbcL基因擴增結果

擴增產物用1.00%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀檢驗，110份野生樣品均在600 bp左右處出現單一、明亮、清晰的條帶。

3.2 rbcL序列分析

除大籽獼猴桃外，同一物種獼猴桃的rbcL序列具有高度保守性，種內差異為0。測序結果進行堿基修正后得到rbcL序列長度約為507 bp。9種獼猴桃樣品中鳥嘧啶+胞嘧啶（G+C）含量整體差異較小，為43.39%～44.38%。見表2。

表2 9種獼猴桃科樣本rbcL序列堿基組成

3.3 遺傳距離分析

9種獼猴桃種間遺傳距離為0.0%～1.8%，其中中華獼猴桃、毛花獼猴桃、浙江獼猴桃、長葉獼猴桃的種間以及軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃種間遺傳距離為0，對萼獼猴桃、黑蕊獼猴桃種間以及對萼獼猴桃、軟棗獼猴桃種間遺傳距離最大，為1.8%。見表3。

表3 9種獼猴桃科樣本種間遺傳距離

3.4 變異位點分析

9種獼猴桃屬植物共產生變異位點10個，其中根據195 bp處的胸腺嘧啶（T）堿基可以將貓人參來源物種（對萼獼猴桃和大籽獼猴桃）與另外7種獼猴桃進行區分鑒定，根據182 bp處的腺嘌呤（A）堿基和426 bp處的鳥嘧啶（G）堿基可以將葛棗獼猴桃與其余物種進行區分鑒定，根據227 bp處的T堿基、239 bp處的G堿基和258 bp處的胞嘧啶（C）堿基可以將軟棗獼猴桃和黑蕊獼猴桃與其他物種進行區分鑒定。見表4。

表4 9種獼猴桃科樣本變異位點分析

3.5 系統聚類樹分析

以水東哥屬的水東哥rbcL序列為外類群，貓人參及其近緣種的ML系統聚類樹見圖1。聚類結果表明，葛棗獼猴桃、大籽獼猴桃、對萼獼猴桃聚為一支，其中對萼獼猴桃與本研究采集并測得的大籽獼猴桃序列聚為一支；其余6種獼猴桃聚為一支，其中軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃與Genbank上下載的大籽獼猴桃序列聚為一支。通過聚類分析，可以將貓人參與其他物種獼猴桃進行區分鑒定。

圖1 貓人參及其近緣種的系統聚類樹

3.6 rbcL基因序列二級結構分析

貓人參及其近緣種的rbcL序列二級結構見圖2。從中可以看出，二級結構圖與遺傳聚類分析及系統聚類分析結果相似，作為貓人參來源的對萼獼猴桃和大籽獼猴桃具有其特有的二級結構，可明顯與其他物種獼猴桃進行區分。

圖2 貓人參及其近緣種的脫氧核糖核酸二級結構

4 討論

4.1 基于rbcL序列對貓人參及其近緣種鑒定的可行性分析

植物葉綠體基因與核基因相比具有相對分子質量小、結構簡單等特點，且葉綠體DNA屬于細胞質遺傳，進化速率較快，適用于植物親緣學分析［14］。rbcL序列全長約1 kb，具有種內進化速率低、種間進化速率高的特點，在石斛屬［15］、菊科［16］等多種藥用植物中體現了較好的鑒別優勢。

貓人參為獼猴桃屬植物，屬于嚴格的葉綠體基因組父系遺傳，這一罕見而特殊的遺傳方式極大地提高了獼猴桃屬植物親緣關系的復雜性［17］。有學者基于簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）以及多種葉綠體DNA條形碼等分子生物學手段對獼猴桃屬的親緣關系及遺傳多樣性進行了研究［17-18］，但尚缺乏對貓人參的物種鑒定研究。本研究發現，貓人參基源物種對萼獼猴桃和大籽獼猴桃具有獨特的堿基變異位點，且聚類分析對萼獼猴桃和大籽獼猴桃聚為一支，其DNA二級結構也與其他物種明顯不同。因此，rbcL序列在貓人參的物種鑒定中具有較好的應用效果。

4.2 基于rbcL序列對獼猴桃屬植物進行分子鑒定的可行性分析

本研究發現，rbcL序列可用于貓人參的物種鑒定研究，然而對獼猴桃屬部分物種的鑒定能力較差。本研究中，中華獼猴桃、毛花獼猴桃、浙江獼猴桃、長葉獼猴桃的基因序列一致，軟棗獼猴桃和黑蕊獼猴桃的基因序列一致，將毛花獼猴桃在Genbank上進行檢索比對，比對分值為100%的有浙江獼猴桃、中華獼猴桃、黑蕊獼猴桃、小葉獼猴桃等多個物種，說明基于rbcL序列在Genbank數據庫中比對，尚不能對獼猴桃屬植物進行完全鑒定。這可能與本文所選取的片段為rbcL部分片段有關，片段長度越短，所包含的堿基變異位點相應越少，然而片段長度越長，PCR擴增率及測序成功率相應降低。因此，對于獼猴桃屬植物的鑒定，尚需要對葉綠體基因長片段或多片段聯合序列對獼猴桃屬植物的鑒定能力開展進一步研究。

4.3 貓人參藥材DNA條形碼鑒定的意義

貓人參在浙江、江西、福建等地被廣泛應用，臨床抗腫瘤效果明顯，尤其對于胃癌及肺癌細胞抑制作用明顯，然而其藥用部位為地下根，在栽培基地尚未普及的情況下，目前貓人參野生資源已近匱乏。另一方面，貓人參具有兩個藥用來源，其一為對萼獼猴桃（俗稱“白貨”），其二為大籽獼猴桃（俗稱“紅貨”），白貨和紅貨主要根據地下根的顏色區分。獼猴桃屬其他植物地下部分與貓人參藥材較難區分，而其藥理作用卻具有較大差異。近年來市場上出現了較多貓人參混淆品，其中以黑蕊獼猴桃和中華獼猴桃居多。對貓人參進行準確的物種鑒定是保證臨床用藥安全的前提。

DNA條 形 碼 在 鼠 尾 草 屬［19］、黃 芪［20］、甘 草［21］等多種中藥材的物種鑒定中發揮了巨大優勢，其操作簡便、經驗依賴性小、結果準確可靠。本研究發現葉綠體rbcL序列可用于貓人參的物種鑒定，因此基于DNA條形碼對貓人參進行鑒別具有較大的臨床意義。另一方面，基于DNA條形碼可探討物種之間的系統發育及親緣關系，可為拓寬藥材資源提供一定的參考。