基于UHPLC-Q-Exactive細胞代謝組學技術探討丹貝益肺方對人胚肺成纖維細胞的作用機制

蔡蕭君，李 宇，王 欽，吳圓圓，胡 楊，頡彥鵬

（黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

肺纖維化是一種嚴重的纖維化間質性肺疾病。盡管疾病發展模式不盡相同，但癥狀出現后生存期一般為3～5年［1-3］。患者多數表現出非特定的癥狀和體征，如勞累時呼吸困難、吸氣性爆裂音和無痰干咳等［4-5］。60歲以上有吸煙史的男性，患肺纖維化的風險顯著增加，但確切機制仍不清楚［6-7］。目前認為，異常的肺泡上皮傷口愈合和促纖維化通路激活是肺纖維化的主導誘因［8］。此外，肌成纖維細胞的積聚和細胞外基質的產生導致肺組織瘢痕化，致使肺功能喪失［9-12］。臨床診斷方法多以支氣管鏡和肺活檢等侵入性方法為主，給患者及家庭帶來極大的痛苦和負擔，因此亟待發現靶向性的肺纖維化臨床生物標志物。

臨床上，肺纖維化細胞樣本容易獲得，且針對性強，這為肺纖維化的臨床研究提供了合適的研究對象。隨著組學技術及質譜技術的飛速發展，采用超高效液相色譜和高分辨率質譜聯用（UHPLC-MS）的非靶向代謝譜分析為發現病理調控分子提供了可能。這些分子為發現新的診斷或預后生物標志物提供了機會。

丹貝益肺方由黑龍江省中醫藥科學院江柏華教授依據多年的臨床實踐經驗總結而成，臨床療效顯著［13-17］。本研究在前期實驗結果的基礎上采用代謝組學技術研究人胚肺成纖維細胞（MRC-5）的代謝情況，并以丹貝益肺方加以干預，從代謝通路及關鍵代謝酶角度揭示丹貝益肺方治療肺纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MRC-5購自北京協和細胞資源中心。人胚肺正常細胞購自凱基生物有限公司中心。2-甲氧基乙氧基甲基氯/厄爾平衡鹽溶液（MEM/EBSS）培養基購自北京協和細胞資源中心。四甲基噻唑藍（MTT，美國Sigma公司，批號20200615）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索寶來有限公司，批號P1022）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；青霉素-鏈霉素混合溶液（美國HyClone公司，批號SV30009）；超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨（UHPLC-Q-Exactive）質譜系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）；酶標液M15（上海纖檢儀器有限公司）；XPR205D5/AC分析天平（梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司）；ZJHK-40L超純水機（天津卓精虹科儀器設備技術有限公司）。

丹參、平貝母、桃仁、地龍、川芎、桔梗、黃芪、黨參、補骨脂、麥冬、五味子均購自哈爾濱世一堂有限公司，經黑龍江省中醫藥科學院主任藥師杜虹韋鑒定為正品。

1.2 丹貝益肺方提取物及PBS、MTT溶液制備

丹貝益肺方的組成：丹參、黃芪各30 g，平貝母、黨參、麥冬、桔梗各20 g，川芎、桃仁、五味子、補骨脂、地龍各15 g。以上藥物按照傳統工藝［17］，由黑龍江省中醫藥科學院藥劑科監制，蒸餾水稀釋成1 mg/mL的丹貝益肺方提取物。

將PBS緩慢加入三蒸水，完全溶解后裝入100 mL玻璃小瓶中，用塞子塞緊后用紗布包嚴，用棉線扎緊，高壓蒸汽滅菌后4℃保存，即為PBS溶液。

稱取0.085 g的MTT粉末加入17 mL的PBS溶液中，以0.22 μm一次性過濾器過濾除菌，置-20℃保存，即為MTT溶液。

1.3 實驗分組與處理

將經丹貝益肺方提取物預處理24 h的MRC-5設為給藥組，棄去預處理液，加入細胞維持液，在37℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養72 h后收獲上清液；另取未經丹貝益肺方提取物干預的MRC-5為模型組，未經丹貝益肺方提取物干預的人胚肺正常細胞為空白組，兩組其他處理與給藥組一致。收集三組上清液標本后置-80℃保存，用于代謝組學分析。

1.4 樣本處理

取各組樣本，0℃水浴解凍100 μL，按1∶4比例加入純甲醇400 μL，渦旋震蕩10 min，靜置60 min，14 000 r/min離心15 min，離心半徑為16 cm。取上清液用于代謝組學檢測。

1.5 各組細胞代謝組學測定

采用UHPLC-Q-Exactive質譜系統，色譜柱為Accucore RP-MS Column（100×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水、B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫條件：0～4 min，99%A；4～5 min，99%A→25%A；5～6 min，25%A→15%A；6～9 min，15%A→1%A；9～10 min，1%A→99%A。

質譜采集模式首先分別以正負離子模式下的全掃模式對所有樣本進行采集，掃描范圍50～1200 m/z，其中，正離子電壓噴霧電壓3500 V、負離子電壓噴霧電壓2500 V、鞘氣流量40 Arb、輔助氣流量6 Arb、反吹氣流量0 Arb、離子傳輸管溫度350℃。批量掃描后，將各組樣本各自混合，再運用Acequire X模式的數據依賴性掃描進行一級、二級數據的精準定性采集。

1.6 MTT法檢測細胞增殖抑制率

活細胞線粒體內膜呼吸鏈中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的深紫色甲臜結晶狀顆粒并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。甲顆粒能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，在一定細胞數量范圍內，MTT結晶量與細胞數成正比，在570 nm波長處測定，可反映活細胞的數量。給藥組給予50 μg/mL的丹貝益肺方提取物，再向各組加入含有10%FBS的MEM/EBSS培養液，置于37℃、5%的CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養72 h。在避光條件下加入20 μL的MTT（5 mg/mL），置于37℃、5%CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養4 h后，取上清液加入150 μL的DMSO溶液，搖勻置于酶標儀，490 nm讀取吸光度（OD）值。設置無細胞只加空白培養基為調零組，每組設6個平行孔。利用OD值計算細胞增殖抑制率，設OD值為A，細胞增殖抑制率=（給藥組A-調零組A）/（模型組A-調零組A）×100%。

1.7 數據分析

采用Compound Discoverer 3.1數據處理系統對采集的全掃數據及包含一級、二級碎片信息的Acequire X定性數據，進行數據預處理及模式識別分析。通過無監督的主成分分析方法（PCA）對所有樣本進行多維數據的組間評價。PCA能客觀反映各組樣本的組間差異和總體趨勢，對模型評價及藥物干預作用有客觀及全面的指導意義。進一步通過t檢驗及偏最小二乘判別分析（PLS-DA）篩選空白組和模型組間的差異離子信息，結合火山圖信息，通過Fold Change及P值的大小確定差異離子，并通過mzCloud及mzVault構建的標準品數據庫進行鑒定。最后通過Metaboanalyst 4.0在線工具對差異離子進行富集分析，聚焦肺纖維化的發病機制及丹貝益肺方可能的干預機制。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制情況比較

與空白組比較，模型組細胞OD值降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，給藥組細胞OD值升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。給藥組細胞增殖抑制率為94%，明顯高于模型組。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制情況比較（n=6）

2.2 代謝組學結果

整體代謝輪廓如圖1所示（以正離子模式數據為例）。空白組、模型組和給藥組聚類明顯，給藥組與空白組呈部分重合狀態，證明丹貝益肺方對MRC-5有顯著的干預作用。模型組整體與空白組及給藥組差距較大，證明MRC-5與人胚肺正常細胞的代謝有明顯差異。

圖1 各組樣本主成分分析得分圖

進一步采用PLS-DA對空白組和模型組間進行對比篩選，選擇Fold Change大于1且P＜0.05的成分作為差異離子，并以可視化形式將兩種數據以火山圖橫縱坐標形式進行整合，見圖2。結合PLS-DA火山圖，選擇遠離原點的數據作為判定依據進行篩選，見圖3。

圖2 空白組和模型組的火山圖

圖3 空白組和模型組偏最小二乘判別分析圖

生物標志物鑒定是代謝組學的難點和重點，為達到對差異成分的精準鑒定，本部分采用一級母離子數據和二級碎片信息數據相結合的方法對代謝物質譜信息進行解析，同時比對標準品數據庫信息進行鑒定，最終得到6個差異代謝物，分別為溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、左旋肉堿、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺。見表2和圖4。鑒定過程以PE、左旋肉堿、谷氨酰胺及谷氨酸為例。見圖5。

圖4 人胚肺成纖維細胞生物標志物含量箱型圖

圖5 差異代謝物二級鑒定過程

表2 人胚肺成纖維細胞生物標志物詳表

為明確MRC-5代謝異常的通路及代謝過程，將上述結果帶入在線數據處理系統進行通路富集分析，結果見圖6。主要涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝、D-谷氨酰胺代謝等。將相關代謝物及代謝通路匯總繪制肺纖維化細胞代謝通路示意圖，見圖7。

圖6 人胚肺成纖維細胞代謝通路富集分析

圖7 人胚肺成纖維細胞代謝通路圖

3 討論

近年來，受環境變化的影響，肺纖維化患者逐年增加，但臨床上有效且不良反應小的藥物尚未被發現。丹貝益肺方是黑龍江省中醫藥科學院江柏華教授依據多年臨床經驗總結而成，療效顯著，但其存在組方復雜、成分頗多、作用靶標不明確等問題，嚴重制約了本方的推廣。

目前，隨著儀器和分析技術的飛速發展，組學技術正逐漸成為解決生命科學問題的主力手段，其中代謝組學是在基因組、蛋白組、轉錄組之后新興的組學技術。不同于以往常規的檢測方法，代謝組學采取高通量的檢測手段對生物體宏觀代謝進行綜合考察。因此，本課題基于細胞代謝組學，采用UHPLCQ-Exactive質譜技術對丹貝益肺方作用靶標進行研究，為丹貝益肺方治療肺纖維化提供可靠數據支撐，以期發現新的生物標志物用于臨床診斷和處方指導。

本研究共得到6個差異代謝物，分別為LPC、PEs、左旋肉堿、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。LPC可調節許多直接參與肺纖維化的基因表達，如一氧化氮合酶、生長因子（如表皮生長因子、血小板衍生生長因子和黏附分子），還可調節細胞增殖和遷移［16］。Mizobuchi等［18］發現磷脂酶A2可將磷脂酰膽堿轉化為LPC，參與溶血磷脂酸生成，抑制自交軸蛋白表達，降低肺纖維化患病概率。本研究發現，給與丹貝益肺方提取物干預后，LPC水平表現出回調趨勢，表明LPC可能對肺纖維化有抑制作用。

PE是生物膜中含量第二豐富的磷脂，與LPC一起構成了大多數真核細胞膜的骨架。PE對細胞分裂至關重要，但PE缺乏時，細胞線粒體因形態異常無法完成細胞分裂和分離。有研究表明，細胞中PE的增加會提高氧化能力，而脂質氧化的增加是神經系統疾病的一個共同特征［19-20］。此外，有研究認為PE水平的升高可以作為肺癌的診斷標志［21］。本研究中，給與丹貝益肺方提取物干預后，PE表現出上調趨勢，表明PE升高可能對肺纖維化有抑制作用。

有研究表明，肺組織中的游離肉堿水平可能與進行性肺氣腫有關，而三羧酸（TCA）循環的上調導致腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）生成增加，氣道腔中細胞外ATP水平的增加通過炎癥細胞的募集和激活，加速炎癥和組織降解，與肺纖維化發病機制相關［22］。本研究中，模型組細胞中左旋肉堿含量呈升高趨勢，給藥組左旋肉堿含量下調，表明丹貝益肺方提取物干預可以有效抑制肺纖維化。

谷氨酰胺是細胞增殖和生長的代謝產物之一，經谷氨酰胺酶脫氨基生成谷氨酸，谷氨酸脫氫生成α-酮戊二酸進入TCA循環為細胞氧化供能。研究表明，轉換生長因子-β1（TGF-β1）可增強谷氨酰胺酶1的表達，從而增強肌成纖維細胞中的谷氨酰胺分解；阻斷谷氨酰胺分解或沉默谷氨酰胺酶1，可減少TGF-β1誘導的肌成纖維細胞分化［23］。本研究發現，經丹貝益肺方提取物干預后，谷氨酰胺呈下調趨勢，且基本達到正常水平，提示其可能參與抑制肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化過程。

既往肺纖維化生物標志物研究中未發現天冬氨酸、谷氨酸，本研究發現經丹貝益肺方干預后二者均呈上調趨勢，但其明確的分子機制還需進一步深入探究。目前已有研究報道，抗氧化多肽的抗纖維化活性與殘基天冬氨酸、組氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺密切相關［24］，表明天冬氨酸與肺纖維化存在相關性。

本研究旨在直觀分析MRC-5的代謝表達譜，為確定肺纖維化診斷和治療的代謝標志物提供可靠依據。結果表明，肺纖維化的形成機制較為復雜，涉及精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝及D-谷氨酰胺代謝等通路。這些代謝物的變化與肺纖維化及其他肺部疾病密切相關，可作為預測肺纖維化發展的群體標志物，代謝調節可能是肺纖維化新療法發展的一個目標。