基于Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)評價三化湯對大腦中動脈閉塞大鼠的影響

王天華，劉麗珠，燕富琳，欒 皓，李永謙，張玉坤，李 燕，趙海軍

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2.齊魯工業(yè)大學，山東 濟南 250353）

中風具有發(fā)病急、病死率高的特征，且由于長期缺乏有效的治療措施，已成為人類健康的最大威脅之一［1］。世界衛(wèi)生組織流行病學調查結果顯示，我國中風發(fā)病率位居世界首位，70%～85%的患者遭受長期殘疾的痛苦［2］。因此，提高患者的運動能力及生活質量是中風研究領域的主要目標之一。

Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)被認為是評估動物運動和步態(tài)損傷最靈敏的工具之一［3］，最初用來評估大鼠在脊髓損傷前后的活動情況［4］。近年來，該系統(tǒng)在中風動物模型功能缺損評估中的應用逐漸增多［5-7］。既往研究顯示，Catwalk系統(tǒng)對缺血性中風后的運動能力改變表現(xiàn)出高度敏感性［8］。

中醫(yī)認為氣機失調為中風發(fā)生的始動因素，玄府閉塞、腑氣不通是中風發(fā)生的重要機制之一。腑氣不通可阻滯機體氣機，導致患者臟腑陰陽失調，誘發(fā)中風。中醫(yī)經典名方三化湯出自劉完素《素問病機氣宜保命集》，為通腑法治療中風的代表方劑，經過長時間的臨床實踐，療效可靠［9］。本研究結合Zea Longa評分與Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)分析運動參數(shù)，綜合評價三化湯對于改善大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠運動功能缺損的作用，為研究通腑法治療中風、改善中風后運動功能提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級成年雄性Wistar大鼠36只，體質量（250±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物使用許可證號SCXK（京）2016-0006，動物飼養(yǎng)于國家中醫(yī)藥管理局微循環(huán)三級實驗室。獲得山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號SDUTCM 20190311012）。飼養(yǎng)條件為12 h/12 h-明/暗循環(huán)，溫度23～25℃，相對濕度45%～50%，自由進食顆粒食物和水。

1.2 實驗藥物

三化湯藥物組成及用量參照劉完素［10］《素問病機氣宜保命集》，大黃、枳實、厚樸、羌活四味藥各等分，購于山東新中魯中醫(yī)院，經山東中醫(yī)藥大學李峰教授鑒定，分別為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatumL.）的干燥根和根莖，蕓香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）的干燥幼果，木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalisRehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮，傘形科植物羌活（Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang）的干燥根莖和根，均符合《中國藥典》2020年版標準。藥物處理按浸泡、煎煮、過濾等步驟操作，將兩次水煎液混合濃縮至含生藥0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL三種質量濃度；西藥尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字H14022821，規(guī)格：20 mg）為陽性對照藥，使用前用生理鹽水溶解成質量濃度為0.72 g/L的懸濁液。三化湯水煎液保存至4℃冰箱備用，尼莫地平懸濁液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實驗儀器

1.4 模型制備

參照Zea Longa的方法復制MCAO模型［11］，造模前使用異氟烷誘導麻醉大鼠，后轉入操作臺持續(xù)麻醉。在頸部腹面正中線右側旁開5 mm行縱行切口，皮下組織深部鈍性解剖后，使用玻璃分針分離暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。用6.0絲線結扎右側頸總動脈近心端和頸外動脈近分叉部，于頸總動脈分叉處近端約5 mm處行動脈切開術，經頸總動脈切口將MCAO栓線植入頸內動脈約20 mm，通過加熱毯控制動物核心體溫始終保持在37℃，切口逐層縫合；大鼠麻醉清醒后，采用Zea Longa神經功能缺損評分法［12］，將評分2～3分的大鼠隨機分為模型組、尼莫地平組、三化湯低劑量組、三化湯中劑量組、三化湯高劑量組5組，每組6只。假手術組大鼠接受同樣的手術，只是將栓線向前推進到頸內動脈約5 mm處。

1.5 給藥方法

三化湯低、中、高劑量組分別灌胃0.43 g/mL、0.86 g/mL、1.72 g/mL質量濃度的藥液；尼莫地平組灌胃藥物為尼莫地平懸濁液0.72 g/L；假手術組與模型組灌胃等體積生理鹽水；每日灌胃1次，共7 d；其他操作均保持一致。

1.6 觀察指標

1.6.1 Zea Longa神經功能缺損評分 分別于造模前（T1）、造模后第1天（T2）、造模后第3天（T3）、造模后第5天（T4）、造模后第7天（T5），對各組大鼠進行Zea Longa神經功能缺損評分，評分標準見表1。

表1 Zea Longa神經功能缺損評分標準

1.6.2 Catwalk步態(tài)數(shù)據采集 利用Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)，從平均運動速度、持續(xù)時間、站立時間、擺動時間、擺動速度、站立行走模式、步幅、爪間寬度8個方面評價大鼠運動功能恢復情況，利用Auto-analysis技術，進行數(shù)據自動讀取分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析，兩組間采用LSD檢驗方法進行兩兩比較，取α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Zea Longa神經功能缺損評分

T1時點，各組Zea Longa神經功能缺損評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；T2時點，5個造模組的Zea Longa神經功能缺損評分均顯著升高，與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；T5時點，三化湯高劑量組Zea Longa神經功能缺損評分低于模型組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠造模前后Zea Longa神經功能缺損評分比較±s，分）

表2 各組大鼠造模前后Zea Longa神經功能缺損評分比較±s，分）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

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2.2 Catwalk步態(tài)分析

2.2.1 整體運動水平

2.2.1.1 站立時間 與假手術組比較，模型組四肢站立時間均明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，三化湯低、中、高劑量組四肢站立時間均明顯縮短（P＜0.01），尼莫地平組四肢站立時間亦縮短（P＜0.05）。與尼莫地平組比較，三化湯低、中、高劑量組右側前后肢（除低劑量組右后肢外）站立時間均縮短（P＜0.05）。見表3。

——司法鑒定管理通過動態(tài)的事后監(jiān)管滿足監(jiān)管機制的創(chuàng)新要求。《實施意見》針對司法鑒定監(jiān)管存在的問題通過監(jiān)管機制創(chuàng)新來解決：一方面跳出了傳統(tǒng)的審核登記管理的靜態(tài)模式，實行了動態(tài)的監(jiān)管模式，強調事中事后的監(jiān)督，為司法鑒定監(jiān)管帶來了新的課題。另一方面，司法鑒定監(jiān)管不僅僅在處罰，還在于激勵。其中，激勵機制的建立不僅會給司法鑒定管理制度帶來監(jiān)管方法的創(chuàng)新，也體現(xiàn)了司法鑒定管理的新理念，對于促進司法鑒定行業(yè)的有序發(fā)展具有重要意義。

表3 各組大鼠單腳站立時間比較（±s，s）

表3 各組大鼠單腳站立時間比較（±s，s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。

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2.2.1.2 平均運動速度及持續(xù)時間 與假手術組比較，模型組與尼莫地平組平均運動速度均下降（P＜0.01）、運動持續(xù)時間均明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，三化湯低、中、高劑量組平均運動速度均增加（P＜0.05）。與尼莫地平組比較，三化湯低、中、高劑量組運動速度均增加（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠平均運動速度及運動持續(xù)時間比較（±s）

表4 各組大鼠平均運動速度及運動持續(xù)時間比較（±s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。

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2.2.1.3 擺動時間 與假手術組比較，模型組四肢擺動時間均增加（P＜0.05）；與模型組比較，三化湯低劑量組四肢擺動時間均下降（P＜0.05），三化湯中劑量組左前肢、左后肢、右后肢擺動時間下降（P＜0.05），三化湯高劑量組左前肢、左后肢、右前肢擺動時間下降（P＜0.05）。與尼莫地平組比較，三化湯低劑量組左后肢、右前肢、右后肢擺動時間下降（P＜0.05），中劑量組左前肢、右后肢擺動時間下降（P＜0.05）；高劑量組左前肢、右前肢、右后肢擺動時間下降（P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠四肢擺動時間比較（±s，s）

表5 各組大鼠四肢擺動時間比較（±s，s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。

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2.2.1.4 擺動速度 與假手術組比較，模型組四肢擺動速度均減慢（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組左前肢、右前肢、右后肢擺動速度提升（P＜0.05）；與尼莫地平組比較，三化湯低劑量組左后肢、右前肢擺動速度快于尼莫地平組（P＜0.05）。見表6。

表6 各組大鼠四肢擺動速度比較（±s，cm/s）

表6 各組大鼠四肢擺動速度比較（±s，cm/s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與尼莫地平組比較，△P＜0.05。

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2.2.1.5 站立行走模式 與假手術組比較，模型組Support_Three模式與Support_Four模式占比增高。與模型組比較，三化湯低劑量組與高劑量組Support_Four模式占比減少；三化湯高劑量組與尼莫地平組Support_Three模式占比相近，三化湯中劑量組占比30.318%，均低于模型組占比53.987%。三化湯各組Support_Diagonal模式占比均大于28%，高于尼莫地平組。三化湯中劑量組與尼莫地平組Support_Girdle、Support_Single步態(tài)模式占比相近；中劑量組與尼莫地平組均出現(xiàn)了Support_Zero步態(tài)模式。綜上所述，用藥各組大鼠步態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的改善，三化湯中劑量組與尼莫地平組步態(tài)分布最接近，同時優(yōu)于尼莫地平組。見表7。

表7 各組大鼠站立-行走模式比較 %

2.2.2 四肢運動水平

2.2.2.1 步幅 與假手術組比較，模型組和尼莫地平組四肢步幅均明顯減少（P＜0.01）。與模型組比較，三化湯低、中、高劑量組四肢步幅均增加（P＜0.05）。見表8。

表8 各組大鼠步幅比較（±s，cm）

表8 各組大鼠步幅比較（±s，cm）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 只數(shù) 左前肢 左后肢 右前肢 右后肢假手術組 6 9.381±1.655 9.889±2.097 8.751±1.139 9.421±1.135模型組 6 3.208±1.804** 4.108±0.673** 4.917±0.882** 4.603±0.643**尼莫地平組 6 3.519±1.193** 4.001±1.473** 5.128±0.698** 5.353±0.390**三化湯低劑量組 6 6.348±0.698# 6.804±1.020# 6.573±0.464# 7.272±0.908#三化湯中劑量組 6 5.738±0.329# 6.808±1.049# 6.580±1.213# 7.353±1.589#三化湯高劑量組 6 6.433±1.268# 6.850±0.848# 6.566±0.539# 7.195±1.491#

2.2.2.2 爪間寬度 與假手術組比較，模型組和尼莫地平組前后肢爪間寬度均明顯寬于假手術組（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平組前肢爪間寬度窄于模型組（P＜0.01），三化湯低、中、高劑量組前后肢爪間寬度均窄于模型組（P＜0.05）。見表9。

表9 各組大鼠爪間寬度比較（±s，cm）

表9 各組大鼠爪間寬度比較（±s，cm）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 只數(shù) 前爪 后爪假手術組 6 4.133±0.161 4.476±0.528模型組 6 6.754±0.481** 7.377±0.532**尼莫地平組 6 5.389±0.291**## 6.527±0.933**三化湯低劑量組 6 5.447±0.792# 5.916±0.193#三化湯中劑量組 6 5.258±0.430## 6.078±0.914#三化湯高劑量組 6 4.940±0.710## 6.019±0.177#

3 討論

三化湯是調暢氣機、開通玄府法治療中風的經典名方，由大黃、枳實、厚樸、羌活組成，其中大黃、枳實、厚樸三藥組成小承氣湯，主治陽明腑實證，主蕩滌積滯、行氣消痞；羌活屬于祛風藥，張璐在《本經逢原》中稱羌活是“卻亂反正之主帥”，有調順之義，可使諸臟功能失調歸于平和，唐代甄權的《藥性論》記載羌活有治療手足不遂、口眼歪斜之功效。諸藥合用，共奏宣行氣血、通腑開結、調暢氣機、開通玄府之功。

在缺血性腦中風發(fā)作后，患者多出現(xiàn)心煩意躁、頭昏脹痛、神志不清等腸熱腑實之證，導致病情進一步加重［13］。有報道顯示中風后的臥床患者發(fā)生便秘的比例為30%～60%［14］，三化湯通暢腑氣、降泄陰濁、通調氣血，另可急下存陰避免痰瘀之邪日久化熱，從而緩解病情。

本研究顯示，與假手術組比較，各MCAO模型大鼠Zea Longa神經功能缺損評分均顯著升高；三化湯干預后，低、高劑量組大鼠評分均下降，證實三化湯可明顯促進大鼠神經功能缺損癥狀恢復，隨治療時間的延長，高劑量組干預效果最好，可能與劑量效應影響有關。提示在中風急性期，三化湯可有效緩解痰熱腑實癥狀，改善神經功能缺損情況。

整體運動協(xié)調性與站立時間、擺動時間、擺動速度密切相關。本研究顯示，假手術組大鼠四肢運動功能健全、運動協(xié)調；各MCAO模型大鼠四側肢體平均運動速度降低，運動持續(xù)時間增加、四肢步態(tài)有著不同程度的改變，此與Cao等［15］及Yang等［16］的研究結果一致。三化湯干預后，各劑量組大鼠四肢均有不同程度的步態(tài)周期縮短和擺動速度提升，證實三化湯對改善中風后步態(tài)協(xié)調性有積極作用；且三化湯低、中、高劑量組大鼠運動速度均大于模型組，提示三化湯可明顯改善MCAO大鼠肢體運動功能。

步態(tài)模式作為協(xié)調性評價指標之一，對評價大鼠運動功能具有重要意義。本研究結果顯示，各MCAO模型大鼠均以三只肢體著地站立支撐為主，以保持運動過程中身體的協(xié)調平衡，該結果與姚建寧等［17］的研究結果相似。MCAO大鼠通過調整步態(tài)模式代償性維持身體平衡及運動功能，三化湯干預后各劑量組站立-行走模式均有不同程度調整，證明三化湯可以促進步態(tài)模式的調整和肢體運動功能的恢復。

肢體運動水平與步態(tài)對稱性、肢體的支撐力以及重心的平衡、位移有關，可作為中風后運動康復的參考指標之一。與假手術組比較，各MCAO模型大鼠四肢步幅明顯縮短，三化湯干預后大鼠的步幅增大，提示三化湯對MCAO大鼠四肢運動水平有不同程度的改善作用。與假手術組比較，造模后早期大鼠爪間寬度增加可能是代償患肢作用，協(xié)助大鼠維持軀體平衡、協(xié)調運動等，此與張荻等［18］研究結果一致。

近年來，研究者采用了多種方法來評估中風后的運動功能障礙，如神經評分、前爪放置測試、斷腳測試、脫膠測試、拐角測試和樓梯任務測試等。但這些測試大多無法避免人為干擾，實驗數(shù)據不能完全體現(xiàn)出實驗動物的完全自主性。由于Zea Longa神經功能缺損評分受到測試者主觀影響較大，為了更加客觀準確地評價大鼠運動功能，本實驗將Zea Longa神經功能缺損評分與Catwalk步態(tài)分析相結合用以評價MCAO大鼠運動功能的改善情況。通過Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)對大鼠的不同步態(tài)進行動態(tài)和靜態(tài)參數(shù)采集，準確記錄四肢與爪子的運動情況，還可以檢測步態(tài)協(xié)調的空間和時間，這對于四足動物研究尤其有價值。本研究顯示，Zea Longa神經功能缺損評分與Catwalk步態(tài)分析結果保持一致，大鼠造模后四肢運動水平和整體運動水平均下降，出現(xiàn)運動功能障礙。經三化湯干預后低、中、高劑量各組大鼠運動水平呈現(xiàn)不同程度的改善，提示中風后早期介入三化湯治療，對運動功能改善有積極作用。

本實驗運用Catwalk步態(tài)分析系統(tǒng)分析了三化湯對MCAO大鼠四肢運動水平與整體運動水平的影響，證實了三化湯從腸腑論治中風的療效，同時為將來對MCAO大鼠治療的行為學研究及步態(tài)數(shù)據采集分析提供了參考。