降低替米考星雜質H的工藝研究

臧亮朋，郭佳，鎖嘉偉，王祎萌(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

替米考星(Tilmicosin)是英國Elanco公司于20世紀末研制成功的一種供畜禽類動物使用的大環內酯類抗生素，其分子式為C46H80N2O13，分子量為869.15[1]。主要以酒石酸泰樂菌素為原料進行半合成。抗菌活性及臨床應用效果與泰樂菌素相比更優。替米考星的結構式如圖1所示。

圖1 替米考星結構式

替米考星的合成途徑為：酒石酸泰樂菌素水解生成中間產物去碳霉糖泰樂菌素，去碳霉糖泰樂菌素與3,5-二甲基哌啶反應經甲酸還原生成替米考星[2]。化學反應式如圖2所示。

圖2 替米考星合成過程

在畜禽養殖過程中經常會出現一種較為常見的疾病即呼吸道疾病，在規模化養殖過程此類疾病帶來的風險更高，因此，有效控制呼吸道類疾病是目前社會關注的焦點，已有諸多報道顯示，呼吸道類疾病的病原菌通常為多種革蘭氏陽性菌及部分陰性菌如巴氏桿菌、放線桿菌、禽大腸桿菌及支原體等，在實際病例中常常是細菌與支原體混合感染[3]。經抗菌活性驗證替米考星抗菌效果優于氟苯尼考、泰樂菌素抗生素類藥物等，其對大部分的革蘭氏菌、螺旋體、霉形體等均有較強的抑制作用，尤其對多種螺旋體和支原體有較強的抑制作用[4]。在我國替米考星有關物質的研究較少，尤其對于單個雜質的考究關注更少，文獻多為綜述替米考星的合成研究進展或進行合成的工藝條件優化。孫永學等[5]介紹了替米考星在臨床上的應用情況。劉德金等[6]通過改變流動相相關物質的比例優化了替米考星的HPLC檢測方法；呂淑榮[7]參照國外相關專利合成了替米考星，對合成產品進行了結構確證，研究了幾個關鍵工藝參數對收率的影響，對合成的替米考星進行了質量研究，但并未系統地研究其最佳的工藝條件。

在我國，目前市售的替米考星及其同類產品的檢測根據《中國獸藥典》規定，將HPLC法作為替米考星檢測的標準方法，美國獸藥典也收錄了替米考星及其同類產品的HPLC測定方法，只是在流動相配制和樣品制備方面存在差異。采用美國獸藥典(USP)有關物質檢測雜質H無法較穩定控制在合格質量標準內，不能滿足客戶要求，嚴重影響該標準要求的產品銷售，為全球的眾多企業生產帶來較大困難。本文主要研究淋洗工藝對替米考星雜質H的影響，篩選淋洗工藝中最佳工藝參數，以期提高替米考星質量，降低雜質H的含量，為替米考星低雜質H成品的生產提供理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002電子天平(上海越平科學儀器有限公司)、恒溫磁力水浴鍋、電磁攪拌器、島津液相檢測儀、watersC18色譜柱、酸度計。

1.2 試劑

酒石酸泰樂菌素精制液(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司)、甲酸、3,5-二甲基哌啶、乙酸丁酯、酒石酸溶液、NaOH溶液、HCl溶液。

2 材料與方法

2.1 原料來源

本試驗原料酒石酸泰樂菌素精制液由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供，以下實驗過程中，單份精制液試驗樣品體積均為200 mL。

2.2 試驗方法

2.2.1 NaOH(10%)溶液配制

準確稱取10 g固體NaOH置于燒杯中，加入90 g的純化水，玻璃棒攪拌使其溶解澄清后封口膜封口備用。

2.2.2 HCl(5%)溶液配制

準確稱取430.56 g純化水置于燒杯中，稱量69.44 g HCl緩慢加入燒杯中，不斷用玻璃棒攪拌使其完全溶解后封口膜封口備用。

2.2.3 酒石酸(5%)溶液配制

準確稱取0.5 g酒石酸銻鉀置于燒杯中，加入少量純化水溶解，再加入到100 mL容量瓶定容。

2.2.4 檢測方法(USP)

用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二正丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，邊加邊攪拌，冷卻后，用磷酸調節pH至2.5±0.1，加水至100 mL(975∶25)為流動相A，以乙腈為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長為280 nm，流速為1.1 mL/min。

3 結果與分析

3.1 泰樂萃取液酸洗及水洗對合成替米考星雜質H的影響

泰樂菌素系列產品眾多，如泰萬菌素、酒石酸泰樂菌素、鹽酸泰樂菌素、替米考星等，這些都屬于大環內酯類抗生素的衍生產品，其中替米考星效果明顯優于泰樂系列其他產品。替米考星有關物質檢測單個雜質較多，而單雜高低不僅影響產品質量也對產品銷售影響較大。在替米考星所有單雜中，雜質H波動頻繁，因此，如何控制或降低替米考星雜質H在質量標準范圍內變得尤為重要。

本文主要以酸洗(5%酒石酸溶液)和水洗(純化水)兩種方式淋洗泰樂菌素萃取液，以未經淋洗的萃取液為對照，泰樂萃取液體積均保證在200 mL，驗證其對替米考星雜質H的影響。具體結果如圖3所示。

將制備完成的泰樂菌素萃取液分別進行酸洗、水洗和不做任何處理進行對照。由圖3可知，采用酸洗和水洗，均對替米考星雜質H有一定影響，經酸洗后，替米考星雜質H得以有效降低，水洗組及對照組替米考星樣品檢測雜質H不合格(標準≤1.0%)；而酸洗后替米考星雜質H含量低于1.0%，因此，可確定對酒石酸泰樂菌素精制液制備完成的萃取液酸洗可有效降低替米考星雜質H，排除水洗，確定優化方向為酒石酸酸洗進行后續驗證。

3.2 泰樂萃取液酸洗pH對合成替米考星雜質H的影響

由以上實驗結果可知，酒石酸酸洗對降低替米考星雜質H效果較好，為確定酒石酸酸洗的工藝條件，首先需要確定合理pH滴加范圍，用酒石酸溶液將泰樂菌素萃取液的pH調節至不同的值，考察不同pH對替米考星雜質H的影響。pH分別調節為6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0進行合成替米考星。具體實驗結果如圖4所示。

由圖4可知，將酒石酸泰樂萃取液等量分為6份，加入酒石酸溶液進行不同pH的調節，然后合成替米考星，檢測替米考星雜質H，結果如圖：在pH=6.5～5.0時雜質H呈下降趨勢，在pH調節至5.5～5.0時，替米考星雜質H達到合格標準(標準≤1.0%)且在pH=5時雜質H最小。繼續調節pH，當PH為4.5，4時，替米考星雜質H逐漸增大且無法達到標準。因此，可確定酒石酸酸洗最佳pH為pH=5.0。

圖4 泰樂萃取液酸洗pH對合成替米考星雜質H的影響

3.3 泰樂萃取液酸洗溫度對合成替米考星雜質H的影響

經上述單因素實驗驗證結果，以酒石酸進行酸洗并將萃取液的pH調節至5.0時，替米考星的雜質H含量達到了合格標準且達到了最優值，但在此過程中，溫度的變化對替米考星雜質H具有顯著影響，因此，對酸洗過程中的最適溫度進行篩選，具體實驗結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著溫度的提升，雜質H呈先下降后上升的趨勢，當溫度小于35 ℃時，雜質H均達到合格標準，且此溫度下達到最低值為0.73，溫度大于35 ℃雜質H均不合格，因此，可確定溫度為35 ℃為最佳的酸洗溫度條件。

圖5 泰樂萃取液酸洗溫度對合成替米考星雜質H的影響

3.4 穩定性實驗

為降低替米考星雜質H，通過對泰樂萃取液淋洗液的選擇、酒石酸調節pH的考察及酒石酸酸洗溫度對替米考星雜質H的考察，確定酒石酸溶液為淋洗液，確定pH=5.0，確定最適宜的酸洗溫度為35 ℃，進行5批穩定性實驗以最終確定最佳考察條件是否穩定。具體實驗結果如表1所示。

表1 穩定性實驗數據表

表1 中所列數據為pH=5.0，酸洗溫度為35 ℃下進行了5批穩定性實驗的數據結果。由表1可知，當確定了酸洗pH及酸洗溫度時，5批實驗樣品檢測雜質H均符合(USP)有關物質單雜檢測標準(標準≤1.0%)。因此，可確定酸洗最佳pH=5.0，最佳的酸洗溫度條件溫度為35 ℃。

4 結語

本研究以泰樂菌素精制液為實驗原料，經過加入乙酸丁酯做萃取劑，加入液堿調節pH至10.0～10.5進行萃取。所得萃取液用酒石酸進行酸洗，調節其溶液的pH為5.0，同時控制酸洗溫度為35 ℃，合成替米考星。

檢測替米考星雜質H，替米考星雜質H均達到合格質量標準，徹底解決了替米考星合成工藝(USP)檢測法中雜質H超標問題。