茶樹內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

張華琳，王科翰，陳雪冰，李東育，張欣欣

（信陽學(xué)院，河南 信陽 464000）

植物內(nèi)生菌（Endophyte）是一類生活在健康植株的各種組織或器官中的微生物，這些微生物不會導(dǎo)致宿主植物產(chǎn)生明顯的病害癥狀，能夠與宿主植物互惠共生、協(xié)同進(jìn)化。常見的植物內(nèi)生菌類群主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。自從第一株植物內(nèi)生菌被分離鑒定出來以后，植物內(nèi)生菌就作為一類重要的微生物資源受到了廣泛地關(guān)注。大量研究發(fā)現(xiàn)，許多內(nèi)生菌能夠穩(wěn)定存在宿主植物內(nèi)部組織或器官中，在植物體內(nèi)完成獨(dú)立分裂繁殖，表現(xiàn)出豐富的群落多樣性。

茶葉作為一種十分重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于保健功能以及獨(dú)特的香氣影響著人們的生活。茶樹內(nèi)生菌主要是指生長在茶樹組織或器官內(nèi)不會引發(fā)茶樹病變的微生物。茶樹內(nèi)生菌由于生長在茶樹的組織和器官內(nèi)，通過與茶樹之間的相互作用，影響著茶樹的生長環(huán)境、生長狀況、代謝產(chǎn)物以及茶葉的風(fēng)味。因此，研究茶樹內(nèi)生菌的分離鑒定、分布和生物學(xué)功能等問題十分重要。本文對茶樹內(nèi)生菌多種研究內(nèi)容進(jìn)行分析和總結(jié)，為茶樹內(nèi)生菌的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供一定的參考和思路。

1 茶樹內(nèi)生菌的分離和鑒定

茶樹內(nèi)生菌的分離和鑒定是研究茶樹內(nèi)生菌的基礎(chǔ)。茶樹內(nèi)生菌能否成功分離的關(guān)鍵是茶樹組織塊的表面消毒，依據(jù)茶樹組織器官、內(nèi)生菌類型以及分離效果等差異，茶樹組織塊的消毒方式也不盡相同。目前已有大量研究，基于傳統(tǒng)的分離方式，通過不斷優(yōu)化分離的方法，已經(jīng)達(dá)到了比較好的分離效果，分離得到的內(nèi)生菌一般會依據(jù)形態(tài)特征和核酸分析等方法進(jìn)行初步鑒定。

劉詩詩[1]對茶樹桂香18號的根、莖、葉進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，共分離出內(nèi)生真菌24株，并對24株內(nèi)生真菌進(jìn)行7種常見植物病原菌的抑菌活性檢測，其中從莖中分離的J-7內(nèi)生真菌具有較強(qiáng)的廣譜抑菌性，且抑菌效果明顯，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法，鑒定該菌株屬于鐮刀菌屬（Fu‐sarium.sp）。李方舟[2]利用培養(yǎng)依賴型的方法對新鮮普洱茶葉片內(nèi)生菌進(jìn)行分離、純化，得到32株內(nèi)生細(xì)菌和14株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌FZ06為芽孢桿菌屬貝萊斯芽孢桿菌種，命名為Bacillus velezensis FZ06。單文娜[3]等人通過對福建茶樹內(nèi)生放線菌的研究，從16個(gè)茶樹品種的根、莖、葉中分離獲得46株內(nèi)生放線菌，鑒定為11個(gè)科，13個(gè)屬，其中優(yōu)勢菌株為鏈霉菌屬。此外，研究也表明了茶樹內(nèi)生放線菌具有廣泛抑菌、抗菌和促進(jìn)植物生長的活性。茶樹內(nèi)生放線菌同茶樹內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌一樣具有巨大的資源開發(fā)價(jià)值。然而，現(xiàn)階段對于茶樹內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌的分離和鑒定研究很多，而對內(nèi)生放線菌的研究很少。

2 茶樹內(nèi)生菌的分布特點(diǎn)

茶樹內(nèi)生菌種類豐富，具有多樣性。主要表現(xiàn)在：不同茶樹品種其內(nèi)生菌組成具有明顯差異，同種茶樹不同組織器官中的內(nèi)生菌種類和數(shù)量也存在明顯差異。汪立群[4]等人對處于同一栽培管理水平下種植的紫娟和云抗10號的內(nèi)生菌的多樣性進(jìn)行對比分析，結(jié)果表明：不同茶樹品種間內(nèi)生菌群落組成存在較大差異。從紫娟中分離得到內(nèi)生真菌5株，分屬于4個(gè)屬，從云抗10號中分離得到內(nèi)生真菌共12株，分屬于4個(gè)屬。現(xiàn)階段可以利用Ⅰllumina MiSeq測序技術(shù)，對不同茶樹品種的內(nèi)生菌群落進(jìn)行分析，研究不同茶樹品種對其內(nèi)生菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響。此外，也可以研究地理位置、氣候變化、茶葉葉齡、樣品采摘時(shí)間等多種因素對茶樹內(nèi)生菌分布的影響，并進(jìn)一步探究這些因素是如何影響茶樹內(nèi)生菌群落分布的。

3 茶樹內(nèi)生菌的生物學(xué)作用

茶樹內(nèi)生菌存在于健康茶樹的各種組織和器官內(nèi)部，與茶樹互惠互利，在一定程度上對茶樹的生長具有直接影響，通過影響茶樹的代謝產(chǎn)物及進(jìn)程，進(jìn)而影響茶樹的品質(zhì)以及茶葉的風(fēng)味。而茶樹內(nèi)生菌的存在，不僅能夠促進(jìn)茶樹的生長，而且在提升茶樹對Al3+耐受力，降解茶樹植株中積累的農(nóng)藥，防治茶樹病原微生物，促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化等方面也發(fā)揮了重要的作用。

3.1 促進(jìn)茶樹的生長

在茶樹生長發(fā)育的過程中，宿主植物與內(nèi)生菌相互作用，促進(jìn)植物生長調(diào)節(jié)激素的合成，通過直接作用促進(jìn)植株的生長。曾秀麗[5]等人用分子遺傳學(xué)方法，證實(shí)了從紫娟茶樹中分離得到的水生草螺菌在茶樹生長過程中具有多條生長素合成途徑。合成的生長素對茶樹的生長具有一定的調(diào)節(jié)作用，具有顯著的促進(jìn)生長的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)茶樹在重金屬脅迫下，茶樹內(nèi)生菌可以通過改變土壤根系環(huán)境的pH值，釋放胞外酸性磷酸酶，溶解磷酸鹽，通過螯合、離子交換等多種方式，提高植物對于磷、鉀土壤肥料的吸收和利用，間接促進(jìn)植物生長[6]。

3.2 促進(jìn)茶樹對鋁的耐受力

在酸性土壤條件下，鋁毒是限制植物生長的關(guān)鍵因素之一。土壤中Al3+的過量累積，對植物的影響主要表現(xiàn)在：破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響酶活性和礦質(zhì)元素的吸收，抑制遺傳物質(zhì)的合成，抑制根、莖、葉的生長等。

茶樹作為Al3+的高富集植物，Al3+主要積累在根部。研究表明，內(nèi)生菌可提高茶樹對鋁的耐受性。可以采用平板對峙等鑒定方法從茶樹中分離并篩選出提高茶樹耐鋁性的內(nèi)生菌，然后對其進(jìn)行Al3+吸附實(shí)驗(yàn)，探究分離鑒定出的內(nèi)生菌是否具有提高茶樹對鋁的耐受力的能力。武平安[7]以小麥、茶樹為材料探究茶樹內(nèi)生青霉菌的耐鋁特性，證明了青霉菌對于植物解除鋁脅迫具有一定的作用，茶樹內(nèi)生青霉菌在PDA培養(yǎng)基上可耐受200 mmol/L Al3+。由此可見，茶樹抗鋁毒的特性與其內(nèi)生菌有著密切聯(lián)系，但是茶樹內(nèi)生菌是如何提高茶樹對鋁的耐受力的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步深入研究探討。

3.3 降解茶樹中積累的農(nóng)藥

茶葉是我國重要的出口產(chǎn)品，近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民的生活質(zhì)量不斷提升，食品安全問題成為關(guān)注的焦點(diǎn)。茶葉的農(nóng)藥殘留問題受到高度的重視，農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為限制我國茶葉出口的一個(gè)關(guān)鍵因素之一。據(jù)調(diào)查得知，各地區(qū)茶葉農(nóng)藥殘留檢出率普遍較高，目前關(guān)于茶樹內(nèi)生菌降解農(nóng)藥的生物降解方法鮮有報(bào)道。

王曉霞[8]等人從龍井茶葉片中篩選分離得到能夠降解有機(jī)磷農(nóng)藥的內(nèi)生真菌ES-4，并且，研究發(fā)現(xiàn)主要是由于內(nèi)生真菌ES-4產(chǎn)生的降解酶能夠?qū)τ袡C(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行有效降解，證明了茶樹中存在能夠降解農(nóng)藥的功能性內(nèi)生真菌。所以可以針對多種不同的農(nóng)藥，設(shè)計(jì)試驗(yàn)分離鑒定篩選對各種農(nóng)藥起降解作用的茶樹內(nèi)生菌，并探究其降解農(nóng)藥的機(jī)制，為茶葉農(nóng)藥殘留問題提供一種新的解決思路。

3.4 防治茶樹病原微生物

在茶樹生長過程中，茶樹能夠與其內(nèi)生菌相互作用，提高茶樹對病原微生物的抗性。李雪嬌[9]從油茶健康的葉片上，通過平板對峙、16SrDNA測序等鑒定方法，分離鑒定得到一株對油茶軟腐病病菌具有顯著抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌，編號為L46的淀粉芽孢桿菌，此細(xì)菌通過導(dǎo)致軟腐病菌菌絲畸變，使細(xì)胞破碎死亡，抑制其生長，達(dá)到病害的防治作用。黃曉琴[10]等人采用同樣的分離鑒定方法，從茶樹健康組織上篩選得到能夠顯著抑制冰核細(xì)菌生長的內(nèi)生菌，鑒定為解淀粉芽孢桿菌Y1，防治茶樹霜凍害。張林平[11]等人通過平板對峙、發(fā)酵復(fù)篩的方法，從健康油茶葉片中分離鑒定得到6株內(nèi)生細(xì)菌菌株，其對油茶炭疽病具有較強(qiáng)的拮抗作用，其中3株為芽孢桿菌屬，3株為梭形芽孢桿菌屬，其抑菌率可高達(dá)82.4%，最低為66.0%。因此，利用茶樹內(nèi)生菌自身優(yōu)勢，能夠最大限度的發(fā)揮生物防治作用，有效減少病菌對茶樹的侵害作用，幫助茶樹抵抗脅迫環(huán)境，對于茶的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要的意義和價(jià)值。

3.5 促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化

我國對茶的種植可以追溯到漢朝時(shí)期，茶樹是一種良好的經(jīng)濟(jì)作物，含有多種藥用成分，葉片制成的茶為一種健康的飲料。茶樹與其內(nèi)生菌相互作用，能夠有效促進(jìn)茶葉成分的轉(zhuǎn)化從而改善茶葉的品質(zhì)，形成獨(dú)特的風(fēng)味。發(fā)酵是形成茶色、茶香、茶味特征的關(guān)健工藝，在多種制茶過程中，往往需要進(jìn)行一定程度的發(fā)酵，而發(fā)酵很大程度是多種微生物和茶樹共同作用的結(jié)果，茶樹內(nèi)生菌也在發(fā)酵過程中起到重要作用。

路偉堯[12]通過對普洱茶生長環(huán)境的空氣微生物、茶葉中的內(nèi)生菌、制作發(fā)酵過程中的微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品種普洱茶制備過程中存在的微生物不同，普洱茶獨(dú)特風(fēng)味及品質(zhì)與茶樹內(nèi)生菌的代謝活動有著直接關(guān)系。多酚氧化酶在茶樹生長代謝過程及茶葉制作加工中發(fā)揮極大的作用。所以，可以采用鑒別培養(yǎng)基篩選法，以酚類物質(zhì)為底物，從茶樹內(nèi)生菌中篩選得到產(chǎn)多酚氧化酶的內(nèi)生菌菌株，探究其促進(jìn)茶葉成分轉(zhuǎn)化的機(jī)制。一些內(nèi)生菌還可能產(chǎn)生天然色素，所以可以探究這些內(nèi)生菌產(chǎn)生的微生物色素能否影響茶的成色。

3.6 影響茶樹次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生

茶樹作為多年生常綠木本植物，次級代謝產(chǎn)物含量豐富，如茶多酚、表兒茶素、咖啡堿、茶氨酸等具有降脂、抗氧化、消炎抑菌、緩解心理壓力等多種功效。研究表明，內(nèi)生菌能夠參與宿主植物體內(nèi)的次生代謝途徑，誘導(dǎo)合成多種代謝產(chǎn)物。

常慢慢[13]以茶和油茶組織培養(yǎng)苗為材料，對分離得到的內(nèi)生菌進(jìn)行UPLC-MS/MS鑒定，證明了茶樹內(nèi)生菌能夠以氨基酸為底物高效合成茶氨酸，當(dāng)以賴氨酸為底物時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。所以，可以通過茶樹內(nèi)生菌與茶樹組培苗共培養(yǎng)方法，分離篩選得到能夠促進(jìn)茶樹組培苗生長的內(nèi)生菌，并探究這些內(nèi)生菌是否可以影響宿主茶樹代謝產(chǎn)物，如茶多糖、咖啡堿以及兒茶素的含量。目前，內(nèi)生菌對茶樹有益代謝產(chǎn)物合成的促進(jìn)是提升茶葉品質(zhì)的一個(gè)重要方向，因此，徹底研究茶樹內(nèi)生菌與茶樹代謝產(chǎn)物積累的關(guān)系可提升茶葉的品質(zhì)進(jìn)而提升茶葉的經(jīng)濟(jì)效益。

4 展望

目前，關(guān)于禾本科植物內(nèi)生菌的研究較為豐富，但對茶樹內(nèi)生菌的研究較淺，多數(shù)研究都停留在茶樹內(nèi)生菌的分離和鑒定上，茶樹內(nèi)生菌對茶樹生命活動影響的具體作用機(jī)制還不夠清晰。茶樹內(nèi)生菌由于生長在茶樹的組織和器官內(nèi)，通過與茶樹之間的相互作用，影響著茶樹對其生長環(huán)境的應(yīng)答、生長狀況、代謝產(chǎn)物以及茶葉的風(fēng)味。因此，需要更加深入地研究，清晰內(nèi)生菌與茶樹之間相互作用的機(jī)制，為茶葉生長和生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)，同時(shí)可以更好地開發(fā)植物內(nèi)生菌的資源，創(chuàng)造一定的社會價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。