基于多酚質量傳遞規律視角下的余甘子質量標準研究思路

仇 敏 謝慧娟 羅傳紅 李格菲 張定堃 樊三虎 黃浩洲 林俊芝

(1 成都中醫藥大學藥學院/創新產業研究院,西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都,611137; 2 成都市三勒漿藥業集團四川華美制藥有限公司,成都,610045; 3 成都中醫藥大學附屬醫院,代謝性疾病中醫藥調控四川省重點實驗室,成都,610072)

余甘子是大戟科葉下珠屬落葉小喬木余甘子PhyllanthusemblicaL.的成熟果實,是我國西南地區特色藥食同源品種。具有清熱涼血,消食健胃,生津止咳等功效。主要用于治療血熱血瘀、消化不良、腹脹、口干、咳嗽[1]。余甘子風味獨特,初食苦澀,回味甘甜,富含維生素C、礦物質、微量元素、氨基酸等活性物質,營養豐富,保健功能顯著,在降糖、調節血脂代謝、預防牙齦炎等方面作用突出[2]。目前,以余甘子入藥的中成藥近80種,相關專利(中國)超過3 000項[3],在食品藥品、保健品、化妝品等行業應用廣泛,其經濟、社會、生態多重價值及影響力逐年攀升。

多酚(鞣質)類成分是余甘子的主要活性成分,也是余甘子質控的重要指標,但余甘子中鞣質類成分化學性質并不穩定,易于發生水解氧化等反應,而沒食子酸、鞣花酸等是其鞣質水解終產物之一[4]。由于余甘子多酚這種易于轉化的特性,導致其在貯藏加工乃至檢測過程中,以沒食子酸為主的指標性成分含量不斷變化。因此,2020年版《中華人民共和國藥典》及各地方標準,以沒食子酸含量為評控指標難以標準其質量,主要存在以下3個問題。首先,單以沒食子酸缺乏特征性與專屬性,如五倍子、拳參、藍布正等均以此為含測指標。而沒食子鞣質如柯里拉京等,具有較強生物活性[5],卻并未作規定。其次,沒食子酸是水解鞣質中沒食子鞣質的苷元,在加熱條件下藥材沒食子酸增加。2020年版《中華人民共和國藥典》以回流法制備供試品,會導致所測得的沒食子酸含量明顯偏高,難以準確評價藥材質量。最后,余甘子中的沒食子酸的含量限度值得商榷。余甘子藥材中沒食子酸的含量會隨著貯藏加工逐步增加,但鞣質類活性成分含量隨之降低[6]。因此,如何制定沒食子酸含量限度,如何更加全面評價其質量,還需進一步探討。為此,本文基于余甘子多酚質量傳遞規律,結合余甘子目前應用現狀及現有余甘子各國各地方標準,對余甘子質量標準研究思路與制定進行探討。

1 余甘子基源及資源分布

余甘子始載于晉代《南方草木狀》[7]稱庵摩勒,書中描述了余甘子植物具有“葉細似合昏”“花黃”“青黃果實似李”及“核圓作六七棱”的植物性狀。在北魏時,有將余甘子和橄欖視為同物的現象,到明代《本草綱目(下冊)》[8]載:“狀如川楝子,味類橄欖”,并指出“橄欖形長尖,余甘形圓,稍有不同,葉形亦異,蓋二物也。”,由此可知,余甘子和橄欖的植物形狀和功用在明代已得到較明確的區分。清代《植物名實圖考》[9]對余甘子枝葉和果實的描繪與P.emblicaL.的性狀特點吻合,由此確定余甘子藥材基原為大戟科葉下珠屬植物余甘子P.emblicaL.的果實。

余甘子是常見的散生樹種,適應性強,多種環境下均能生長,被譽為造林先鋒樹種[10]。余甘子在我國東南沿海及西南等地區廣泛分布,野生資源主要分布在我國云南省、廣西壯族自治區南部和西南部地區、貴州省南部和四川省西南部區域。其中,云南省是最主要的余甘子野生資源分布區域[11]。廣西、廣東、福建地區多栽培,其中福建全省的資源蘊藏量大約為23萬畝[12]。

2 余甘子中主要活性成分

2.1 多酚類 余甘子含有多種酚類成分,鞣質類成分主要有訶黎勒酸、柯里拉京、訶子次酸和訶子酸等,酚酸類成分主要有沒食子酸、鄰苯三酚、沒食子酸酯等。陳靜等[13]采用流式細胞術研究發現,以訶黎勒酸和柯里拉京為主的鞣質能發揮抗腫瘤作用。訶黎勒酸能誘導視網膜母細胞瘤細胞的凋亡[14]。郭志英等[15]提出原訶子酸、柯里拉京、沒食子酸、鞣花酸等成分具有良好的降血糖活性。范源等[16]通過臨床試驗和動物試驗,證實沒食子酸的降血脂功效。余甘子中多酚和黃酮類化合物能夠對抗乙醇誘導的肝線粒體功能障礙以及酶和非酶抗氧化水平和肝結構的改變,發揮保肝作用[17]。見圖1。

2.2 黃酮類 余甘子中含有多種黃酮類成分,主要有槲皮素、兒茶素、沒食子兒茶素、蘆丁、表兒茶素等。馬美等[18]和吳登攀等[19]研究發現,余甘子的提取物、總黃酮均可抑制乳腺癌細胞的增殖。宋琳琳等[20]發現余甘子總黃酮對大鼠的佐劑性關節炎有一定的干預作用。孔秀娟等[21]通過建立小鼠肺部炎癥病理模型,發現余甘子總黃酮具有較好地抑制甲型H1N1流感病毒的作用。見圖1。

2.3 萜類及甾醇類 余甘子中含有多種萜類及甾醇類化合物,如葉綠素及其衍生物、β-谷甾醇等。曾煦欣等[22]通過研究小鼠的扭體和耳郭腫脹實驗,結果顯示具有抗炎鎮痛作用的物質主要為沒食子酸、槲皮素和β-谷甾醇。張玉潔[23]研究發現余甘子枝葉中異柯里拉京和羽扇豆醇對病毒抑制效果好。見圖1。

2.4 多糖類 余甘子各器官皆含有多糖類化合物[24]。鄭寶東和曾紹校[25]采用鄰苯三酚自氧化法和DTNB比色法,發現余甘子多糖提取物具有抗氧化活性。曹莉莉等[26]采用比濁法發現,余甘子多糖具有抑菌活性及群體感應抑制活性。王銳[27]采用體外化學模型,研究表明余甘子多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶有抑制活性。見圖1。

2.5 其他營養物質 余甘子果實中富含維生素C、礦物質硒及鋅、鈣等16種微量元素,18種氨基酸,具有提高血紅蛋白的含量、降低耗氧量、抗氧化、抗疲勞等作用[28]。

3 余甘子干燥-貯存-提取過程中多酚(鞣質)的質量傳遞規律

多酚(鞣質)類成分是余甘子的主要活性成分,也是余甘子質控的重要指標。研究發現,不同批次、來源的余甘子化學指紋圖譜相似度低,不同批次余甘子藥材色譜圖的相似度低,沒食子酸和鞣花酸等指標性成分含量差異極大,往往高達數十倍(2.03～31.83 mg/g和4.34～39.39 mg/g)直接導致其藥理活性差異顯著[29-30]。不同的加工過程會使余甘子中沒食子酸、鞣花酸、柯里拉京、訶黎勒酸差異明顯[31]。如余甘子鹽炙過程中不同加水量、鹽比例及炮制溫度對其成分含量影響明顯[32]。研究發現,余甘子中鞣質類成分化學性質并不穩定,易于發生水解、氧化等反應,例如在加熱過程中,訶黎勒酸中的酯鍵發生斷裂,水解生成柯里拉京與訶子次酸,柯里拉京中酯鍵斷裂后可水解形成鞣花酸、沒食子酸與葡萄糖,而鞣花酸因低溶解度生成沉淀[33]。

余甘子質量差異的形成原因與影響因素可大致歸納為生物效應、微生物效應與熱效應。不同的立地條件促使余甘子中多酚類成分含量差異明顯,線狀真菌、酵母、細菌等多種微生物分泌的單寧酶易使鞣質酯鍵斷裂產生復雜的中間產物及小分子化合物。在余甘子干燥,炮制加工,貯藏等過程中伴隨的大量加熱過程,致使余甘子中的多酚成分的氧化、水解、聚合等反應持續進行,沒食子酸、鞣花酸等小分子終產物含量不斷變化。見圖2。因此,僅以沒食子酸為指標,難以準確有效評價其質量。

4 余甘子質量標準與炮制規范

4.1 余甘子質量標準比較分析 我國余甘子應用形式多樣,《中華人民共和國藥典》《香港中藥材標準》《藏藥標準》《廣西壯族自治區壯藥質量標準》所收載的為余甘子干燥果實,余甘子是少數民族習用藥材,但藏藥與壯藥標準缺少了對余甘子質量的相關評價,只有《中華人民共和國藥典》與《香港中藥材標準》對余甘子指標成分進行了定性定量檢測,測定指標分別為沒食子酸、沒食子酸與鞣花酸總量。福建與廣東傾向于余甘子鮮用,關注了維生素C與鞣質的含量。《英國藥典》與《印度藥典》收載的余甘子應用形式為余甘子的去核果肉,課題組前期實驗發現,余甘子果核多酚類成分豐度以及抗氧化活性遠小于果肉,建議將余甘子果肉與不去核果實分為2種商品規格[34]。英國與印度含量測定對鞣質總量進行了相關規定,現行余甘子標準含量測定皆是將鞣質類成分作為余甘子的指標成分。見表1。

表1 余甘子質量標準比較

4.2 各版各地方中藥飲片炮制規范比較分析 經查閱《中華人民共和國藥典》及各版各地方中藥飲片炮制規范,《安徽省中藥飲片炮制規范》中記載余甘子炮制方式為取原藥材,除去雜質,篩去碎屑[35]。《重慶市中藥飲片炮制規范及標準》中記載炮制方式為除去雜質,洗凈,干燥[36]。《福建省中藥飲片炮制規范》中記載藥用部位為余甘子樹皮,炮制方式為除去雜質,洗凈,燜潤,切絲,曬干[37]。《湖南省中藥飲片炮制規范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質,干燥[38]。《四川省中藥飲片炮制規范》中記載炮制方式為取余甘子鮮果,洗凈,切成片狀或塊狀,低溫或真空干燥[39]。《甘肅省中藥炮制規范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質,揀去腐爛變質者,篩去灰屑。如用于配制軟膏劑時,要除去核[40]。《內蒙古蒙藥飲片炮制規范》中記載炮制方式為取原藥材,除去雜質,藥用余甘子粉則取凈余甘子,研細粉,過篩,即得[41]。各省市的余甘子炮制方法存在較大差異,炮制后余甘子的活性成分也明顯不同,但在《中華人民共和國藥典》以及各省市炮制規范中卻并未對余甘子炮制工藝參數與炮制質量標準進行相關規定,余甘子炮制存在記載不一,且炮制標準缺失的問題等。

5 我國余甘子現行質量標準存在的問題及探討

比較現行余甘子質量標準與藥理研究可知,多酚(鞣質)類成分是余甘子最主要的活性成分與指標成分,但其在干燥、炮制、貯藏、提取過程等環節易發生水解、氧化、聚合等反應,沒食子酸、鞣花酸等小分子終產物含量持續變化,現行標準僅對余甘子中的沒食子酸進行測定存在問題。

5.1 含量測定指標有待商榷 2020版《中華人民共和國藥典》中,余甘子含量檢測項下規定余甘子按干燥品計算,沒食子酸含量不得少于1.2%,這一指標的選擇及限度值得商榷。沒食子酸在富含鞣質的藥材中普遍存在,如《中華人民共和國藥典》中委陵菜、拳參、藍布正等均以此為含量測定指標,單以沒食子酸作為余甘子含量測定指標缺乏特征性與專屬性,難以標準其品質。此外,余甘子中含有大量沒食子鞣質,它們水解后能形成沒食子酸,是沒食子酸的持續來源。在余甘子中,沒食子酸分子可分為游離沒食子酸和形成鞣質部分的非游離沒食子酸。不難發現,《中華人民共和國藥典》及地方標準中,希望測定的是游離沒食子酸,但不少地方標準要求余甘子飲片以鮮果切片凍干形式生產,此時沒食子酸主要以非游離形式存在,其游離的沒食子酸含量難以達到《中華人民共和國藥典》等規定的1.2%要求。此外,依據《中華人民共和國藥典》方法加熱回流提取余甘子供試品制備過程中會導致沒食子酸的含量偏高[4]。可見,《中華人民共和國藥典》方法測得的沒食子酸實際上包含了沒食子鞣質所水解釋放的沒食子酸。因此,若想規避這一問題,只能在制備方法中盡量避免沒食子鞣質的水解。

然而,僅僅測定余甘子中天然存在的沒食子酸也存在不足之處。研究發現,除了在藥材提取階段,余甘子藥材在貯藏過程中,受環境和微生物等因素的影響,鞣質類成分也會不斷分解形成沒食子酸。這意味著對于余甘子而言,無論何時,沒食子酸的釋放是持續進行的。現代藥理研究發現,余甘子中的沒食子鞣質也具有明確的藥效與生物活性,具有抗氧化、抗菌、抗病毒與抗腫瘤等作用。因此,可以推斷,余甘子的質量評價,還需要考慮還未水解成沒食子酸的鞣質部分,即余甘子的質量評價應綜合測定游離沒食子酸和非游離沒食子酸(可水解生成沒食子酸的鞣質)。在《香港中藥材標準》中,以沒食子酸與鞣花酸作為質控指標,但鞣花酸同為水解鞣質中鞣花鞣質的苷元,也存在上述類似情況。因此,無論以沒食子酸或鞣花酸作為余甘子的含測標準,都存在合理性不足的問題。

5.2 檢測手段有待提高 目前,隨著檢測技術的快速發展,關于植物中沒食子鞣質和沒食子酸的定性定量及快速檢測方法發展十分迅速。本文篩選出以下幾種方法供參考,主要可分為水解法和光化學法等評價方法。水解法可參考同樣以沒食子酸為含量測定指標物質的多酚類藥材五倍子。2020版《中華人民共和國藥典》中五倍子的含量測定項下[1],在供試品溶液制備過程中,指出采用強酸性環境下充分加熱水解3.5 h后測定沒食子酸含量,以此可測定出余甘子藥材中總共可以釋放出的沒食子酸含量,即為游離沒食子酸與非游離沒食子酸的總量。運用甲醇短時間超聲提取余甘子進行含量測定,可抑制鞣質的水解,較準確地測定出游離沒食子酸的含量[4],而非游離沒食子酸為二者差值,此方法具有操作簡單,準確度高,對操作人員和儀器設備要求相對較低等優點,適用于《中華人民共和國藥典》方法檢測。

水解法雖原理簡單、可操作性強,但伴隨著較長時間的前處理,難以實現快速檢測的需求。沒食子酰基是沒食子鞣質與沒食子酸共有結構,其具有鄰苯三酚這一特征結構,該結構是識別并檢測沒食子酰基的關鍵。近年來,流動注射與化學發光法的結合在食品、藥物、生物分析等領域具有廣泛的應用[42]。選用合適的顯色劑結合化學發光法,可快速表征沒食子鞣質和沒食子酸含量,是一種靈敏度高、線性范圍寬且成熟的分析技術。Kanwal等[43]建立了一種用于2種以上鄰苯三酚化合物檢測的流動注射與化學發光法系統,該系統依賴于鄰苯三酚在磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)的弱堿性介質中對KMnO4-H2O2體系化學發光信號的增強影響。由于該系統能夠對同時存在的多種鄰苯三酚化合物進行檢測,因此十分適宜于測定藥材中以不同形式結合存在的沒食子酰基。不過該系統可能還會受到余甘子中其他具有連苯三酚結構的物質的干擾,例如一些黃烷醇與黃酮類成分。雖然其專屬性目前來說并不占優勢,但沒食子酰基結構化合物在余甘子中占比極高,它仍可能是一種非常適合余甘子質量快速評價的方法。

5.3 現代炮制工藝有待規范 已有研究表明,余甘子在各民族有各自的炮制方式,例如鹽制、牛奶制、蜜制、醋制等,且在炮制過程中,余甘子中的物質基礎會發生顯著變化,但在《中華人民共和國藥典》以及各省市炮制規范中并未對余甘子炮制工藝參數進行相關規定,例如余甘子的炮制溫度、炮制輔料、炮制時間等,不同的炮制工藝下余甘子的物質基礎差異較大,影響臨床有效性的發揮。因此,可將“傳統功效-炮制工藝-活性成分”進行關聯研究,在優選余甘子功效質量標志物的基礎上,確立合理、規范、可控的現代炮制工藝。

5.4 余甘子藥用形式多樣 2020年版《中華人民共和國藥典》規定余甘子的基源為大戟科植物余甘子P.emblicaL.的干燥成熟果實,但余甘子在不同國家、醫藥體系和歷史時期中藥用形式多樣[1]。余甘子鮮果及果汁干粉在印度以及中國廣東、福建等地常用,而余甘子干鮮品的化成分差異明顯,但余甘子鮮干功效差異研究卻很少見[44]。此外,《英國藥典》與《印度藥典》收載的余甘子應用形式為余甘子的去核果肉,課題組前期實驗發現,余甘子果核多酚類成分豐度以及抗氧化活性遠小于果肉,建議將余甘子果肉與不去核果實分為2種商品規格[45]。余甘子樹皮為西雙版納傣醫習用藥材,但進行急性毒性時發現余甘子樹皮灌胃給藥,對小鼠有一定毒性。余甘子是世界范圍的多民族用藥,其各種藥用形式需進行更加完善的藥理藥效學研究,以確保用藥的有效性和安全性。

隨著余甘子生態環境價值、農業經濟價值以及藥用價值不斷被發現,其逐漸展露出了農業種植以及中藥大品種培育與開發的潛力。作為藥食同源、活性成分易轉化的中藥品種,余甘子質量標準制定應考慮其特殊質量形成與傳遞規律,構建適應余甘子在多元化產品發展中需求的質量標準。