肝癌來源的外泌體中miRNA的作用

張嬌弟，馬夢婷，張 倩 綜述，劉欣躍，2△ 審校

蘭州大學第二醫院：1.藥物基因組學實驗室；2.檢驗醫學中心，甘肅蘭州 730000

外泌體是由多囊體衍生出來的小膜泡，在供體細胞和受體細胞之間穿梭，通過自分泌或旁分泌的方式促進血清和血漿中細胞間通訊的新模式，其作為細胞間傳遞信號的囊泡結構，在腫瘤增殖、侵襲和耐藥中發揮重要作用。腫瘤來源的外泌體中含有諸如核酸、脂類和蛋白質等生物分子，是腫瘤生物標志物和治療載體的潛在來源，其含有的多種RNAs已逐漸被認為是新的生物標志物、病理生理介質、預后指標，甚至是疾病治療的納米藥物。肝細胞癌(HCC)是全球第六大最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的第四大原因[1],雖然肝癌的治療方法多種多樣，但肝癌的預后仍然較差，診斷延遲以及高轉移率、復發率是導致肝癌預后不良的主要原因[2]，因此早診斷早治療對改善肝癌患者預后極其重要。然而目前還沒有有效的生物標志物和技術，因此，探索與HCC相關的分子機制，開發新的HCC臨床預防生物標志物是迫切需要的。現已發現腫瘤微環境在肝癌的發生、發展中起著至關重要的作用。肝癌腫瘤微環境主要由成纖維細胞、免疫細胞和細胞外基質組成，異常的腫瘤微環境與肝癌轉移密切相關。最近的研究表明，HCC中多種信號通路和細胞間通訊失調,而外泌體是細胞間通訊的主要媒介之一，其由多泡體衍生出來的小膜泡與質膜融合后由各種細胞類型分泌而成。外泌體攜帶許多具有多種生物學功能的物質，包括miRNAs，與腫瘤的發生、進展和惡性腫瘤的轉移密切相關[3]。miRNAs是一種內源性非編碼小RNAs，主要存在于真核生物中，研究發現miRNAs在腫瘤發生、轉移和耐藥中發揮著重要作用。在HCC中，miRNAs不僅是一種有效的生物標志物,還具有調節肝癌細胞增殖、凋亡和化療藥物敏感性的作用，并能通過調控相關靶基因抑制腫瘤的發生和進展[4]。因此進一步了解HCC來源的外泌體中miRNAs對HCC的及時診斷和治療具有重要意義。本文旨在綜述肝癌來源的外泌體中miRNAs在肝癌中的一些潛在調控機制及診斷價值，以期為肝癌的早期診斷和精準治療提供新的思路。

1 肝癌中miRNAs的表達

miRNAs有18～25個核苷酸,通過抑制靶mRNAs的翻譯有效地調控基因表達[5]。研究發現 miRNAs可能具有腫瘤抑制或致癌作用，許多研究已經報道miRNAs在包括HCC在內的不同腫瘤中異常表達[6]。在肝癌中，miRNAs可下調或缺失，包括miRNA-26a、miRNA-29c、miRNA-21[7]及miR-424-5p[8]等；相反,致癌性miRNAs包括miR-10b-5p、miR-18a-5p、miR-215-5p、miR-940[9]、miR-122、miR-148a、miR-1246[10]、miR-1251-5p[11]、miR-378b[12]等在肝癌中過度表達。因此肝癌中miRNAs異常表達可作為其診斷、轉移及預后的有效生物標志物。

2 肝癌來源的外泌體中miRNAs的作用

2.1參與肝癌轉移 轉移是HCC患者疾病死亡的主要原因。然而，肝癌轉移的機制尚不清楚。研究發現肝癌來源的外泌體miRNAs可通過誘導腫瘤血管生成、免疫逃逸、細胞外基質重塑、耐藥等介導肝癌轉移。

2.1.1血管生成 血管生成是腫瘤生長和轉移的重要過程，肝癌來源的外泌體首先通過調節和破壞其靶點的組織結構，導致腫瘤血管生成，從而促進肝癌轉移[13]。ZHOU等[14]的研究顯示，外泌體miRNA-21可直接靶向磷酸酯酶(PTEN)，導致造血干細胞中丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(PDK1)/蛋白激酶B(AKT)信號通路的激活，并且miR-21高表達與癌相關成纖維細胞(CAFs)活化程度高、血管密度高相關，活化的CAFs通過分泌血管生成細胞因子，進一步促進了腫瘤的進展；此外，轉化生長因子-β受體Ⅲ(TGFβRⅢ)是一種普遍表達的TGF-β共受體，是TGF-β信號轉導和腫瘤進展的調節劑，包括肝癌的轉移和侵襲。CHEN等[12]發現HCC中miR-378b表達上調，TGFβRⅢ表達下調，miR-378b靶向TGFβRⅢ,miR-378b過表達可促進血管生成和腫瘤生長，耗盡miR-378b可干擾肝癌細胞遷移并促進細胞凋亡，并且下調TGFβRⅢ可逆轉miR-378b下調對HCC細胞的影響，因此miR-378b促進肝癌細胞進展和血管生成，原因可能與TGFβRⅢ相關，可為肝癌的治療提供藥物靶點；相反，外泌體miR-451a作為一種抑癌因子，有研究發現其可誘導HCC細胞系和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的凋亡，LPIN1是miR-451a的一個關鍵靶點，通過調控肝癌細胞凋亡和血管生成抑制HCC的發生[11]。

2.1.2免疫逃逸 腫瘤來源的外泌體可能具有免疫調節特性，影響T細胞功能和腫瘤逃脫免疫監視，誘導免疫耐受，促進腫瘤進展[15]。內質網(ER)應激在腫瘤進展和調節免疫細胞功能中發揮重要作用。有報道稱，肝癌中ER應激標志物水平與巨噬細胞浸潤和PD-L1表達相關,ER應激導致HCC細胞釋放富含miR-23a-3p的外泌體靶向巨噬細胞，miR-23a-3p一旦被巨噬細胞內化，可抑制PTEN的表達，激活磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT通路，上調PD-L1，進一步研究證實外泌體激活的巨噬細胞與T細胞共孵育可下調CD8+T細胞比例，抑制白細胞介素(IL)-2的產生，并誘導T細胞凋亡[16]。將富含miR-146a-5p的外泌體從HCC細胞(小鼠和人)轉移到巨噬細胞中也獲得了類似的結果[17]。因此HCC可能通過高表達PD-L1抑制CD8+T細胞的細胞毒性，介導免疫逃逸。NK細胞是人類肝臟免疫系統的另一個主要組成部分，肝癌細胞如Hep-3B，可以釋放富含miR-92b的外泌體，通過限制CD69抑制NK細胞的作用[18]。NAKANO等[18]分別提取原位肝癌模型大鼠血清和無外泌體血清，靜脈注射裸鼠，前者血清在致瘤組織中顯示高水平的AFP和過表達的miR-92b，而后者未顯示ATP水平異常，ROC曲線證實，患者血清miR-92b水平對HCC早期(AUC=0.925)和晚期(AUC=0.761)復發具有理想的可預測性。從機制上講，血清CD69作為活化T細胞的表面抗原之一，不僅參與淋巴細胞增殖誘導和信號轉導，而且作為重要的介質參與NK細胞介導的細胞毒性，HCC來源的外泌體中過表達的miR-92b在腫瘤微環境中浸潤NK細胞，參與抑制CD69表達，拮抗NK細胞對HCC的細胞毒作用，從而誘導腫瘤細胞免疫逃逸。

2.1.3細胞外基質重塑 細胞外基質的主要成分包括膠原蛋白、纖維連接蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，它們與腫瘤細胞和基質細胞的表型和功能改變有關[19]。外泌體通過介導細胞外基質重塑改變腫瘤微環境，最終促進腫瘤轉移。研究發現來自高轉移性HCC的外泌體富含癌蛋白和RNAs，外泌體被正常肝細胞攝取后，激活PI3K/AKT和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路，誘導活性基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的分泌，促進細胞外基質降解，加速腫瘤細胞遷移和侵襲[20]；上皮-間質轉化(EMT)參與上皮細胞極性喪失、細胞外基質重塑和轉移前龕的形成，增強癌細胞進入循環系統的能力，促進腫瘤細胞轉移，有研究發現外泌體中含有的致癌miRNAs參與了EMT的調控[21]。然而，外泌體是否促進肝癌細胞EMT的發生及其機制尚不清楚。有研究發現在EMT過程中，上皮腫瘤細胞在腫瘤基質中CAFs的影響下獲得間充質特征，腫瘤細胞失去極性和細胞間連接，進入低增殖狀態，遷移和侵襲能力增強[22]；CAFs作為腫瘤微環境中最多產的細胞類型，是轉化成纖維細胞的一個子集，促進腫瘤進展和轉移，ZHANG等[23]從HCC腫瘤組織中提取CAFs和癌旁成纖維細胞(PAFs)進行培養并分離出外泌體，分析發現，與PAFs相比，CAFs來源的外泌體miR-320a水平更低，miR-320a可以直接靶向前B細胞白血病同源盒3，抑制MAPK信號通路的激活，從而抑制轉移，這表明miR-320a水平的降低可能促進肝癌的轉移。最近的一項研究表明，高轉移性肝癌比低轉移性肝癌更易將正常成纖維細胞轉化為CAFs[24]，因為HCC合并肺轉移患者血清外泌體miR-1247-3p水平明顯高于無肺轉移患者，外泌體miR-1247-3p直接靶向β-1,4-半乳糖基轉移酶Ⅲ(B4GALT3)，導致成纖維細胞中β1-整合素/NF-κB信號通路激活,從而將成纖維細胞轉化為CAFs，活化的CAFs通過分泌IL-6、IL-8和促炎細胞因子促進肝癌細胞的轉移，增強肝癌細胞的干細胞特性和EMT。這些數據提示，HCC細胞來源的外泌體miR-1247-3p可促進炎癥微環境和肺轉移。

2.1.4肝癌耐藥 腫瘤細胞耐藥使藥物療效降低，導致患者預后不良。近年來，越來越多的研究表明腫瘤來源的外泌體可以通過多種機制促進耐藥。外泌體可將耐藥相關蛋白和miRNAs運輸到靶細胞，實現耐藥細胞與敏感細胞、基質細胞與腫瘤細胞之間的信號傳遞，誘導腫瘤細胞耐藥[25]。ZHANG等[4]的研究發現外泌體miR-199a-3p表達水平與HCC中順鉑(DDP)耐藥相關，上調miR-199a-3p可逆轉腫瘤的化療耐藥性，減緩了腫瘤在體內的生長。同樣LOU等[26]證明miR-199a-3p水平增高與HCC阿霉素(Dox)化療敏感性呈正相關，miR-199a-3p具有調節潛在靶標、結合細胞、抑制細胞入侵、刺激細胞凋亡和減弱細胞功能的能力，其在肝癌耐藥細胞中內化可通過抑制mTOR通路介導藥物高敏感性,DDP或Dox化療后顯著抑制腫瘤細胞增殖和轉移，并伴有細胞凋亡率升高。此外越來越多的證據表明外泌體miRNAs參與了索拉非尼耐藥機制。miR-32-5p在肝癌耐藥組織中過表達，耐藥癌癥組織釋放的外泌體將miR-32-5p轉移到索拉非尼敏感的HCC細胞中，通過抑制緊張素同源物PTEN激活PI3K/AKT通路，從而促進血管生成和EMT，介導肝癌的多藥耐藥[27];在HIRAO等[28]的研究中發現，miR-125-5p誘導肝癌細胞(PLC/PRF5)索拉非尼耐藥，并且PLC/PRF5-miR-125-5p顯示出更高的遷移和侵襲能力，進一步研究發現，miR-125-5p抑制 ataxin-1，從而誘導EMT和腫瘤干細胞特性。miR-744在索拉非尼耐藥HepG2細胞來源的外泌體中表達降低,當使用miR-744過表達的外泌體處理時，HepG2細胞的增殖顯著受到抑制，索拉非尼耐藥性降低[29]。因此，miR-744在HCC的增殖和化療耐藥性中具有重要作用，血清外泌體miR-744可能作為HCC的生物標志物，可為HCC治療提供創新策略。以上表明，miRNAs的表達狀態將成為HCC患者治療選擇有效藥物的標志物。

2.2作為肝癌早期診斷的生物標志物 早期發現HCC對于治療和改善其預后至關重要，然而早期發現HCC具有挑戰性，因為該病通常無癥狀進展。超聲雖為肝癌監測的首選方法，但存在診斷準確性低等局限。甲胎蛋白(AFP)為肝癌最常用的血清學檢測，但對早期HCC診斷的敏感性較低[30]。超聲與AFP聯合使用雖然可以提高檢出率，但可能增加假陽性和成本，其他腫瘤生物標志物，如凝集素結合的AFP、磷脂酰肌醇聚糖3、高爾基體蛋白73等，也不能有效提高診斷的準確性[15]。因此，尋找HCC早期檢測的敏感、特異的生物標志物極其重要。液體活檢是一種無創的癌癥診斷方法，近年來受到廣泛關注，循環腫瘤細胞和循環腫瘤DNA是最常用的液體活檢方法，外泌體miRNAs也被認為是液體活檢標本[31]。SOROP等[30]的研究表明，HCC患者來源的外泌體中miR-21-5p上調，miR-92a-3p下調，基于AFP診斷HCC的AUC為0.72，將AFP、外泌體miR-21-5p、miR-92a-3p 納入HCC診斷的Logistic回歸方程后，其AUC為0.85，顯著優于AFP，因此外泌體miR-21-5p和miR-92a-3p可與AFP一起作為篩查HCC的潛在生物標志物。ZHANG等[32]的研究顯示3種血清miRNAs (miR-92-3p、miR-107和miR-3126-5p)聯合AFP可以很好地將早期HCC患者和AFP低水平HCC患者與對照組區分開來。另外有研究顯示HCC來源外泌體中miR-122、miR-148a和miR-1246的表達水平明顯高于肝硬化組和正常對照組，但與慢性肝炎組無明顯差異，miR-148a對早期HCC和肝硬化的鑒別效果較好(AUC=0.891)，明顯優于AFP(AUC=0.712)，且miR-122、miR-148a和AFP聯合使用可進一步提高AUC至0.931，miR-122是區分HCC和正常對照組的理想選擇(AUC=0.990)[10]。這些數據表明，肝癌來源的外泌體miRNAs與傳統生物標志物的結合可能進一步提升其診斷的準確性。最近的一項研究綜合分析3種不同的人肝癌RNA測序數據集miRNAs表達譜，發現血清外泌體miR-4661-5p在HCC所有分期(AUC=0.917)，甚至早期(AUC=0.923)均具有良好的診斷性能，其準確性高于其他候選血清外泌體miRNAs和血清AFP，此外，由外泌體miR-4661-5p和miR-4746-5p組成的外泌體miRNAs面板被認為是早期診斷HCC最準確的生物標志物(AUC=0.947)[33]。因此血清中多種外泌體miRNAs的存在為外泌體液體活檢技術在HCC早期診斷中的臨床應用開辟了廣闊的前景。

3 小 結

外泌體作為小型外囊泡，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用，了解外泌體的生理功能對于闡明它們如何影響癌癥進展至關重要。外泌體通過物質運輸介導細胞間信號轉導，誘導不同受體細胞的生理或病理生理過程。外泌體miRNAs 參與調控肝癌細胞與腫瘤微環境之間復雜的相互作用，并通過特定的方法如腫瘤血管生成、細胞外基質重塑、EMT、耐藥和免疫逃逸等介導肝癌的發展。因此，外泌體miRNAs作為肝癌診斷和預后的生物標志物或為未來HCC抗腫瘤策略的靶點提供了一個新的潛在角度，對其特異調控機制的相關研究可為肝癌的精準治療提供潛在靶點。同時，基于外泌體miRNAs的液體活檢技術也為多發性惡性腫瘤的早期診斷和預后評估提供了一種無創、有前景的選擇。盡管外泌體miRNAs具有許多優點，但在臨床應用中仍面臨一些關鍵問題，如分離和純化方法有局限性，如費時、費力，缺乏大規模的前瞻性研究，無法提供液體活檢可以替代腫瘤組織活檢的證據，產生外泌體miRNAs的細胞類型不同等，這在臨床上必須加以控制。因此，需要進行更多的研究來解決這些問題，并開發出更有效的外泌體miRNAs應用于臨床。