CNV-seq與染色體核型分析在產前診斷中聯合應用的價值

吳漢鋒，趙 輝，黃家亮，甘桂春，李炎炎

廣西壯族自治區貴港市婦幼保健院遺傳實驗室，廣西貴港 537100

出生缺陷是人口出生素質下降的主要因素，是導致早期流產、死胎、嬰幼兒死亡和先天殘疾的主要原因，其中染色體結構及數目變化所致的遺傳疾病約占出生缺陷的80%以上[1]。產前診斷即在胎兒出生前利用醫學檢驗、細胞遺傳學、分子及基因檢測、醫學影像學等檢測手段了解胎兒在宮內的狀態，在胎兒出生前確診先天性疾病和遺傳性疾病，從而進一步進行宮內治療或產前干預。產前診斷是預防遺傳疾病的重要環節，是避免遺傳病患兒出生的有效手段。雖然染色體核型分析技術多年來被視為產前診斷的“金標準”，但由于技術方法的局限性，只能辨別染色體5～10 Mb以上的片段異常，染色體微小結構的變異和其他基因變異不能被檢出，所以染色體核型分析需和其他遺傳檢測技術相結合進行檢測，提高染色體小片段異常檢出率。LIANG等[2]介紹了基于二代測序技術的基因組拷貝數變異測序(CNV-Seq)方法，CNV-seq具有檢測范圍廣、操作簡便、報告周期短、兼容性好等優點?！兜蜕疃热蚪M測序技術在產前診斷中的應用專家共識》指出，孕婦可以選擇CNV-seq檢測作為一線的產前診斷方法，前提是孕婦充分知情了解[3]。本研究探討CNV-seq和染色體核型分析技術在產前診斷中的應用價值，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年2月至2021年12月在本院優生遺傳科就診的1 155例孕中期孕婦為研究對象，1 155例孕婦均具有產前診斷指征。產前診斷指征包括高齡妊娠(n=256)、孕中期血清學唐氏篩查高風險(n=97)、無創產前篩查高風險(n=89)、不良孕產史(n=90)、B超影像學軟指標異常(n=485)等。孕婦年齡17～48歲，孕周20～28周，排除雙胎及多胎妊娠者。根據不同孕周選擇羊膜腔穿刺術或臍靜脈穿刺術，抽取羊水和臍帶血在2 h內送至本院遺傳實驗室進行接種培養，報告1個月內發出；CNV-seq檢測當天將標本按要求寄往深圳華大醫學檢驗實驗室檢測，報告15 d內發出。所有孕婦及家屬在侵入性產前診斷前均接受臨床醫生詳細的遺傳咨詢，充分提示孕婦及家屬穿刺術所帶來的風險及檢測方法的局限性，孕婦及家屬知情了解后簽署染色體核型分析和CNV-seq知情同意書。

1.2方法

1.2.1染色體核型分析 優生遺傳科醫生在超聲監測下穿刺抽取羊水20 mL，臍帶血穿刺抽取1.5 mL，所有操作均按無菌要求進行。羊水及臍帶血染色體核型分析實驗操作過程均為雙人雙線平行操作，按標準操作要求進行室內質控和參加全國室間質評。蔡司全自動染色體掃描儀掃描染色體圖片，利用染色體分析軟件進行分析和計數，兩線分別計數至少10個分裂象，分析至少5個完整清晰染色體核型并保存歸檔，命名規則按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)標準進行，如有異常核型則加量計數和分析。

1.2.2CNV-seq檢測 孕婦簽署知情同意書后，在超聲下引導無菌穿刺抽取羊水10 mL，穿刺抽取臍帶血1.5 mL，抽取孕婦外周血5 mL，標本按要求寄送至深圳華大醫學檢驗實驗室檢測。所有標本常規進行聯合短串聯重復序列(STR)連鎖分析及母源污染鑒定。深圳華大醫學檢驗實驗室采用高通量測序技術，對受檢標本提取 DNA進行全基因組測序和生物信息學分析，結合STR和甲基化特異性PCR，測序所得的unique reads 與GRCh37/UCSC release hg19參考基因組進行比對，檢出100 kb以上的微重復微缺失變異。根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(ACMG)發布的指南進行染色體拷貝數變異(CNV)致病性解讀，對檢測到的CNV的致病性進行評估，將結果分為5類，分別是已知致病變異、疑似致病變異、臨床意義不明變異、良性變異及疑似良性變異，良性變異和疑似良性變異不在報告中體現。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件對數據進行整理。

2 結 果

1 155例羊水和臍帶血均培養成功，均出具染色體核型分析報告。檢出染色體異常97例，異常檢出率為8.39%，其中數目異常63例，包括21-三體37例、18-三體8例、13-三體1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；結構異常25例，染色體嵌合體9例。CNV-seq無檢測失敗現象，出具1 155份報告，檢出染色體非整倍體及100 kb以上的CNV 112例，異常檢出率為9.69%，其中非整倍體63例，包括21-三體37例、18-三體8例、13-三體1例、45，X 3例、47，XXY 10例、47，XXX 4例；已知致病性變異30例，疑似致病變異16例，嵌合體3例。1 155例孕婦標本染色體核型分析與CNV-seq共同檢出異常83例，其中染色體數目異常63例，CNV-seq檢測出非整倍體63例，非整倍體符合率為100%，其他異常20例，見表1；染色體核型異常而CNV-seq未檢出的共14例，包括染色體平衡易位、染色體倒位、染色體嵌合體，見表2。染色體核型未檢出而CNV-seq檢出異常的共29例，見表3。

表1 20例染色體核型分析與CNV-seq檢測均異常結果

續表1 20例染色體核型分析與CNV-seq檢測均異常結果

表2 14例染色體核型分析異常而CNV-seq結果正常

表3 29例染色體核型分析正常而CNV-seq結果異常

3 討 論

本研究中，CNV-seq異常檢出率為9.69%，染色體核型分析異常檢出率為8.39%，CNV-seq檢測的異常檢出率比染色體核型分析高1.30%，與其他研究異常檢出率報道結果相似[4]。CNV-seq與染色體核型分析共同檢出異常核型83例，其中非整倍體63例檢測結果一致，非整倍體檢測符合率100%。其余20例染色體核型為結構缺失、重復、衍生等，由于染色體核型分析技術的局限性，只能分辨大于5 Mb的片段異常，且對異常片段的來源及定位受培養制片和顯帶技術的影響無法準確辨別。表1中的20號病例，染色體核型分析看到的是一個標記染色體，標記染色體片段較小，通常小于同一分裂象中的20號染色體，沒有可供識別的染色體帶紋以提示其來源，但CNV-seq檢測結果提示該標記染色體來源于15q11-13，即15q11-13重復綜合征。該綜合征臨床特征包括自閉癥、智力低下、共濟失調、癲癇發作、發育遲緩和行為問題[5]。胎兒父母進行了CNV-seq檢測，檢測結果顯示母親為15q11-13重復綜合征，母親的臨床癥狀為肌張力低、發育遲緩、抽搐、孤獨譜系障礙，特殊面容，最終該孕婦選擇了終止妊娠。表1中的3、5、8、10、14號病例染色體核型描述為衍生染色體，CNV-seq檢測均對其片段來源及染色體微缺失微重復片段大小進行了快速精準的辨別，為產前診斷臨床咨詢提供可靠的依據。

CNV-seq不適宜用于檢測染色體平衡易位、染色體倒位、染色體整倍體及雜合性缺失(UPD)等，有待于CNV-seq技術的深入研究。表2中的24、25、27、33、34號病例染色體核型描述為平衡易位或羅伯遜易位，21號病例為4號染色體倒位，CNV-seq檢測這些病例結果均為未見異常。由于染色體平衡易位和倒位不涉及染色體片段的丟失和重復，且染色體斷裂重接后沒有影響相關基因的功能，該類患者一般無染色體疾病的表型，只是在生育時會形成異常的配子，導致流產、死產及產生染色體異常后代[6]。本研究中表2的染色體倒位及平衡易位的孕婦均選擇繼續妊娠，隨訪至胎兒出生后表型均未見異常。表2中的29號病例，染色體核型描述為標記染色體，CNV-seq檢測未見異常，表明該標記物只是異染色質，無染色體遺傳物質，親本驗證為遺傳母親核型，母親表型無異常，該孕婦選擇繼續妊娠。由于染色體微小結構變化所導致的遺傳性疾病稱為染色體微缺失/微重復綜合征，傳統的染色體核型分析技術不能夠分辨，缺失或者重復的片段小于5 Mb，是基因組CNV主要表現形式。至今為止，由致病性基因CNV所致的染色體微小結構變化綜合征已達300多種[7-8]，10%～20%的智力障礙患者通過CNV-seq檢測可以找到病因[9-11]，可以確診5%～15%的孤獨癥譜系患兒[12]。本研究表3中的29例患者CNV-seq檢測結果均為小于5 Mb的缺失或重復，其中15例為已知致病變異，14例為疑似致病變異，而染色體核型分析結果均未見明顯異常。41、49、56、59、60、61、62號病例，CNV-seq檢出15q11.211.2區域缺失，該區域與15q11.2缺失綜合征有關，可能會增加神經精神性疾病或神經發育障礙的易感性，包括精神運動發育遲緩、語言發育遲緩、自閉癥、多動癥、強迫癥及癲癇[13]。46、47、50、53、57號病例，CNV-seq檢測結果為22q11.2q11.2區域大小不同片段缺失，該區域包含ClinGen判斷的劑量敏感區域，即22q11.2缺失綜合征。臨床表現為顱面部畸形、先天性心臟病、免疫缺陷和低鈣血癥三大癥狀，新生兒中該病的發病率為1/6 000[14]。CNV-seq檢測技術提高了染色體微缺失/微重復綜合征的檢出率[2.50%(29/1 155)]，同時也給臨床醫生咨詢帶來了挑戰和困難，臨床醫生需要結合臨床及溯源胎兒父母的CNV-seq檢測結果綜合分析。

嵌合體是指兩種或兩種以上的細胞系存在于一個個體中，產前診斷嵌合體分為限制性胎盤嵌合體和真性胎盤嵌合體[15]。本研究表1中的17、19號病例染色體核型分析與CNV-seq均檢出嵌合體，但是嵌合比例不一致，因為異常染色體在體外培養和細胞分裂的過程穩定性較差，造成嵌合比例存在差異，染色體結構也容易發生變異或丟失，所以CNV-seq檢測盡量采用未經培養的羊水和臍帶血[16]。表3中的39號病例，CNV-seq檢測結果為14號染色體存在三體嵌合，異常比例約為39%，而染色體核型未檢測出嵌合體，這種情況下需結合臨床和超聲，以及未培養羊水細胞間期Fish檢測，如果Fish檢測結果是陰性，則為假性嵌合體，后期繼續B超監測妊娠情況。表2中的26、31、32號病例染色體核型出現平衡易位嵌合體，而CNV-seq檢測結果為未見異常，平衡易位嵌合體大多數認為是部分細胞畸變在體外培養時發生，一般無明顯的異常表型。表2中的病例30，染色體核型分析結果為47,XXX[6]/47,XX,+mar[8]/46,XX[99]，CNV-seq檢測未見異常，可能原因是CNV-seq對嵌合體檢測的靈敏度不高，嵌合比例不精準，對于47,XXX與45,X兩種細胞嵌合，若兩種細胞嵌合比例各占50%，CNV-seq檢測結果會顯示X染色體拷貝數未見異常[17]。CNV-seq檢測對于嵌合體的理想檢測比例為<5%，對低比例的嵌合體檢測結果更精準[18]。對于真性嵌合體的鑒別，無論是染色體核型分析還是CNV-seq檢測，建議至少兩種技術檢出嵌合體時才能確立真性嵌合體，只有一種技術檢出嵌合體時，臨床咨詢解釋需謹慎，需結合臨床及胎兒影像學綜合分析。

本研究中，產前診斷指征B超軟指標異常485例，所占比例最高[41.99%(485/1 155)]，其中CNV-seq異常例數43例，占CNV-seq檢測異常例數的38.39%(43/112)，CNV-seq檢測或CMA是產前B超軟指標異常首選的侵入性產前診斷方法[19]。

綜上所述，CNV-seq檢測與染色體核型分析技術各有優缺點，在產前診斷領域中CNV-seq檢測具有良好的應用價值，對小片段的染色體結構異常能夠精準定位及確定片段大小來源，可以作為進行產前診斷的一線方法，但是不能檢出平衡易位及倒位等結構異常，對整倍體異常的檢出也有局限性。兩種方法聯合應用于產前診斷領域，可以提高遺傳病的檢出率，避免遺傳病患兒的出生，改善母嬰健康狀況，提高出生人口素質。