兩種方法檢測結核分枝桿菌的價值分析

曾慶雪，周 明，唐柳生

廣西壯族自治區胸科醫院檢驗科，廣西柳州 545005

結核病是由結核分枝桿菌復合群引起的慢性傳染病，是我國的乙類傳染病，以炎性滲出、增生和干酪樣壞死為主要病理表現。世界衛生組織發布的報告指出，結核病是世界上最重要的傳染性疾病之一[1]。結核病主要影響肺部，但也會影響身體的其他部位，需及早診斷和治療，大多數可以預防。有關流行病學調查結果表明，我國約有93萬人感染了結核分枝桿菌[2]，特別是肺結核排菌患者將菌排出體外，通過空氣傳播，以致他人感染。目前檢測結核分枝桿菌最經濟的方法還是傳統涂片法，現就痰標本涂片用熒光顯微鏡人工閱片(簡稱人工閱片)和自動掃描儀檢測結果進行比較。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院疑似為結核病患者的133例合格痰標本(膿痰47例，血痰9例，黏液痰77例)，同時進行抗酸桿菌涂片和結核分枝桿菌培養。

1.2儀器與試劑 寧波舜宇儀器有限公司生產的結核分枝桿菌FS400顯微鏡掃描系統(簡稱FS400)、寧波舜宇儀器有限公司生產EX30/DMEX30生物熒光顯微鏡。珠海貝索金胺O染色液、珠海貝索中性羅氏培養基、珠海貝索抗酸染色液(萋尼氏法)、N-乙酰-L半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)混合溶液(等體積6%的NaOH溶液和2.9%的檸檬酸鈉溶液混合，每100 mL混合溶液加入0.5 g NALC粉末溶解)，pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液。

1.3方法

1.3.1結核分枝桿菌涂片 用經高壓滅菌的竹簽挑取可疑部分痰液進行涂片，自然干燥后金胺O熒光染色：(1)標本滴加金胺O染液染色15 min，水洗。(2)3%鹽酸乙醇溶液脫色1～2 min或至無色，水洗。(3)加復染劑(0.5%高錳酸鉀溶液)復染2～4 min，水洗。(4)干燥后在暗室鏡檢：首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢，發現疑為抗酸桿菌，使用40×物鏡確認。

1.3.2FS400閱片與人工閱片 經金胺O熒光染色好的133份痰標本涂片用EX30/DMEX30生物熒光顯微鏡進行人工閱片，做好記錄，人工閱片完畢后再放至FS400閱片，結果出來后，把兩種方法閱片結果登記并進行比較。

1.3.3結核分枝桿菌的羅氏固體培養觀察過程 在生物安全柜內將2～5 mL痰標本放入離心管；向離心管內加1～2倍體積的NALC-NaOH混合溶液，渦旋振震蕩后消化15 min直至充分液化；向離心管中加入磷酸鹽緩沖液至45 mL，擰緊蓋子，低溫離心機(8～10 ℃)，3 000×g，離心15 min；取出離心管，小心棄去上清液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液，混勻；把中性羅氏培養基多余的凝固水棄去，每份標本接種兩只培養基，每支培養基接種0.10～0.15 mL(2～3滴)，布滿培養基表面。統計所有結果，對培養長菌標本進行涂片，采用萋尼染色確認培養陽性的結果。

1.3.4菌株涂片進行萋尼染色 (1)菌膜自然干燥后固定，滴加石炭酸復紅染液蓋滿玻片，加熱至出現蒸汽后，停止加熱，染色 5 min，染色期間始終保持菌膜被染液覆蓋，水洗瀝干。(2)滴加5%鹽酸乙醇溶液脫色1～2 min或至無可視紅色染液為止，水洗瀝干。(3)滴加亞甲藍復染30～60 s，沖去染液，干燥后鏡檢。

1.4統計學處理 采用SPSS19.0對數據進行分析。計數資料以百分數表示，組間比較采用χ2檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1133例痰標本采用 FS400和人工閱片檢測的陽性率比較 133例痰標本 FS400掃描出陽性53例，陽性率為39.8%(53/133)，人工閱片檢出陽性34例，陽性率為25.6% (34/133)，兩者比較差異有統計學意義(χ2=6.080，P=0.014)。

2.2FS400和人工閱片檢測結果對比 兩種方法閱片，結果的一致率為84.2%(112/133)，見表1。

表1 FS400和人工閱片檢測結果比較(n)

2.3兩種方法檢測結果不一致者與羅氏固體培養結果的分析 FS400掃描陽性而人工閱片陰性的結果中，羅氏固體培養結果陽性5例；FS400掃描陰性而人工閱片陽性1例，且羅氏固體培養結果為陽性。

2.4羅氏固體培養與FS400、人工閱片結果的比較 以羅氏固體培養結果為金標準，FS400檢測結核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為88.4%(38/43)和83.3%(75/90)，陽性預測值和陰性預測值分別為71.7%(38/53)和93.8%(75/80)；人工閱片檢測結核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為79.1%(34/43)和100.0%(90/90)，陽性預測值和陰性預測值分別為100.0%(34/34)和 90.9%(90/99)。

3 討 論

結核分枝桿菌的檢測工具有很多，但使用最廣泛的是痰涂片鏡檢，在低收入和中等收入國家，使用傳統光學顯微鏡進行痰涂片鏡檢是診斷肺結核的主要方法[3]，為保證顯微鏡檢查的質量，結核病實驗室檢驗規程規定：每天一名鏡檢人員的涂片閱讀量不應超過25張[4]，閱片量遠遠滿足不了臨床的需求與日益增加的標本量。人們已經嘗試采用從顯微鏡下的痰涂片圖像中識別結核桿菌[5]，自動閱片掃描儀的使用對我國控制和及時治療結核病提供了很大的幫助。快速檢測結核病對我國控制及治療結核病至關重要。結核病病原體結核分枝桿菌的檢測技術的不斷改革：從萋尼染色到金胺O染色法，提高了陽性率和特異度[6]。本研究結果顯示，FS400閱片陽性率(39.8%)高于人工閱片陽性率，李強等[7]研究結果顯示，掃描儀陽性率(32.1%)略高于傳統熒光顯微鏡檢查(31.9%)，檢測效能較高，在工作量大的實驗室、特別是人員缺乏的實驗室，掃描檢測技術可以作為傳統檢查的替代工具。金胺O熒光染色法是一種高效率的檢查方法，但容易受到其他熒光染色物質干擾，FS400熒光染色的不足為將非抗酸桿菌也判讀陽性，本研究中FS400實際條數陽性總數為16份標本，人工閱片有14份陰性，占比87.5%(14/16)。抗酸桿菌分離培養是結核病診斷的金標準，因此，抗酸桿菌的培養對結核病早期發現和早期治療控制起到非常重要作用[8]，且培養陽性率較涂片高。兩種閱片方法陰陽性不一致者與培養陽性結果中FS400符合率[83.3%(5/6)]更高，抗酸涂片鏡檢對菌量要求高，靈敏度低，要求菌量達(5～10)×103/mL才能檢出，因此涂片鏡檢陽性檢出率僅30% 左右[9]，FS400靈敏度和陰性預測值較人工閱片高，基于以上統計數據，FS400可以作為篩查工具。

影響掃描儀結果的因素為涂片質量，涂片過厚或過薄，FS400提示涂片陰性異常，無法判讀結果。染色時間較短，熒光無法上色會出現判讀陰性；染色時間過長，雜質也會染上熒光，儀器也會判讀陽性。脫色時間要夠，沖洗一定要干凈，否則儀器會判讀陽性。實驗室操作人員應加強培訓，保證涂片質量的可靠。臨床留取標本是檢驗結果可靠的前提[10]，文獻報道，高質量痰標本涂片檢查的陽性率可達62%[11]，不合格痰標本(唾液)的陽性率僅為1%[12]。只有合格標本才能得到正確的檢驗結果。

金胺O熒光染色法在低倍鏡下可觀察菌體呈亮綠色，背景黑暗，具有清晰的形態特征，不容易出現漏檢情況，使鏡檢效率顯著提高,雜質在熒光顯微鏡藍色激發后，可產生亮綠色熒光，與抗酸桿菌相似，容易與之混淆[13]，鐘麗云[14]及樊曉東等[15]研究顯示，金胺 O 熒光染色法不容易出現漏檢情況，使鏡檢效率顯著提高，可作為診斷結核病的有效手段。

在結核病診斷中使用FS400能夠獲得更高的靈敏度。人工閱片時如果在低倍鏡下見形似抗酸桿菌，尤其是少量分布的形似抗酸桿菌，可調至高倍鏡，或者由經驗豐富的鏡檢人員確認。FS400陽性和異常結果必須經過人工閱片才更為可靠，FS400減輕了工作人員負擔，提高了工作效率，但不能完全替代傳統顯微鏡人工閱片。近年來，醫院患者不斷增多，結核實驗室工作量大幅上升，實驗室空間和工作人員數量日顯緊張，盡管人工閱片更可靠，但人工閱片的速度較慢，王前等[16]研究也證明自動閱片技術診斷病原學陽性肺結核的靈敏度高于人工閱片，可用于患者抗酸桿菌的篩查。FS400說明書強調需要注意掃描儀結果不做最終臨床診斷依據，用戶根據實際掃描圖像進行人工判讀，從而確定被檢標本的最終結果，以防止假陰性而出現漏檢。本研究中FS400陰性而人工閱片陽性標本1例，說明FS400出現假陰性結果，因此，掃描檢測技術需要做進一步改善以便更能滿足臨床需求。但FS400檢測結核分枝桿菌的靈敏度和特異度較高，自動化程度高，值得推廣應用。