實驗兔胸腺取材及檢測方法*

方 慧 田岳鳳

(1.運城第一醫院康復醫學科，運城 044000)(2.山西中醫藥大學第二臨床學院，晉中 030619)

胸腺是T細胞發育成熟的關鍵，機體重要的中樞免疫器官之一。它還可以分泌多種胸腺激素及激素類物質，具內分泌功能。胸腺對于機體的健康有著十分重要的作用，一些免疫力功能低下或自身免疫疾病、腫瘤的發生及衰老等與胸腺密切相關[1]。兔在生物醫學中應用廣泛，主要用于免疫學、生物制品、發熱解熱和檢測致熱源、生殖生理和避孕藥、眼科學、骨骼等多個方面[2]。目前兔在免疫學的應用中，關于其胸腺的論述較少，這可能與其退化和取材的困難性有關。因此本文就兔胸腺的發育退化過程及取材時的注意事項敘述如下，希望可以對一些研究有所幫助。

1 材料和方法

1.1 動物分組

清潔級大耳白兔8只，雌雄各半，體質量(2.18±0.23)kg，由北京昌揚西山養殖場提供【動物合格證號：SCXK(京)2016-0007】，飼養于山西中醫藥大學科研樓，實驗室溫度20～25 ℃，相對濕度45%～65 %，隨機分為空白組、免疫抑制模型組，每組4只。

1.2 儀器和試劑

注射用環磷酰胺(江蘇盛迪醫藥有限公司)(200 mg/瓶，國藥準字H32020857)，恒溫箱(三洋，MIR-262)，石蠟包埋機(孝感亞光，YB-6LF)，顯微鏡(奧林巴斯，BX51)。

1.3 造模及取材

實驗以環磷酰胺制備免疫抑制模型，造模方法以60 mg/kg劑量腹腔注射環磷酰胺，連續造模7 d[7]，空白組連續腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，飼養20 d后進行胸腺組織取材。

2 結果

2.1 一般形態結果

一般形態結果顯示，胸腺多呈左、右雙葉狀，質地偏硬，與脂肪組織比更有韌性。其中空白組胸腺多呈淡粉色，環磷酰胺模型組胸腺多呈白色。

2.2 HE染色結果

圖1 兔胸腺HE染色切片(×200)Fig.1 HE staining of thymus from rabbits (×200)

為了確定取材的結果及胸腺退化的程度，對其進行HE染色，如圖1：空白組胸腺結構完整，皮髓界限清楚，皮質淋巴細胞密集；免疫抑制模型組胸腺失去正常結構，皮髓界限不清，皮質淋巴細胞減少，周圍脂肪組織多。

3 討論

3.1 兔胸腺發育退化過程

胸腺是機體重要的中樞免疫器官，動物和人的胸腺隨著年齡的增長均會逐漸萎縮退化，主要表現為脂肪組織增多、體積變小和初始T淋巴細胞輸出減少，從而導致機體免疫力下降，增加了患感染、腫瘤和自身免疫性疾病的風險。胸腺這種隨年齡增長而發生的形態改變和功能退化被稱為胸腺增齡性萎縮[3-4]。

兔胸腺起于頸部，分為左、右兩葉，大部分位于胸腔前縱隔，在胸骨后面并緊靠心臟，表面有薄層結締組織被膜(圖2)。在兔的生長發育期間，幼兔的胸腺最為明顯，長度約2.5 cm，寬2 cm，厚4 mm。重量為2.3～2.8 g，占總體質量的百分比也最高，但是隨著年齡的增加，該器官也發生著明顯的退行性變化, 主要表現為出現大部分脂肪組織，僅剩下極少的胸腺皮質或髓質，成兔的胸腺幾乎全被脂肪和結締組織填充[5]。

圖2 兔胸腺的解剖位置Fig.2 Anatomical location of rabbit thymus

3.2 具體年齡對應的胸腺狀況

兔從出生到斷奶的時期稱為仔兔期，一般為0～35 d；斷奶當天至3月齡的時期稱為幼兔期，整3月齡的家兔平均體質量在1.7～2.0 kg；滿3月齡至初配前稱為中兔期也稱后備兔，這個時期的家兔4月齡平均體質量2.0～2.3 kg，5月齡平均體質量在2.5～2.8 kg。一般培養、毒性實驗多使用45～90 d的幼兔，慢性實驗使用90～180 d的兔[6]。就目前取材的胸腺發現：尚未開始退化的胸腺呈粉紅色，開始退化之后的胸腺，顏色偏白，這與其大量的脂肪組織增多有關，可能顏色的變化能說明其退化的程度(圖3)。

圖3 兔胸腺組織Fig.3 Rabbit thymus tissue

3.3 取材要點及注意事項

(1)胸腺位置準確定位

將兔麻醉后仰臥位置捆綁固定于兔解剖臺上，因為家兔的胸腺位于胸骨后面并緊靠心臟，基本位于第1～3肋骨處，所以我們找取胸腺時多用手術刀和手術剪沿腹白線向上打開胸腔，先暴露其心臟，發現心臟后繼續向上剪開胸骨，注意此時的動作一定要小心，防止傷及胸腺。在胸腔充分暴露后，多數情況下會發現胸腺就覆蓋在心臟上，呈左、右雙葉狀，還未出現退化情況的胸腺呈淡粉色，已退化的胸腺因組織中脂肪不斷增多其顏色多偏白；還有一些情況會發現胸腺沒有覆蓋在心臟上而是緊貼于胸骨，但是也呈雙葉狀；此外有極少例可能是胸腺已經完全退化,并沒有找到胸腺組織。

(2)明確胸腺的分布區域

用手術鑷夾起覆蓋于心臟上方或胸骨后方的胸腺，稍微向上挑起，會發現它起自于兔頸部的位置，肉眼仔細觀察胸腺起始的這個區域，為之后的取材打下基礎，防止取材到一半不知道這個部分是不是自己要的。因為胸腺與縱隔脂肪組織的真正界限比較難以確定，尤其是已經發生退化的胸腺組織。

(3)取材方法

因為胸腺表面有薄層結締組織被膜，讓其緊貼于心臟上方或胸骨后方，因此在取材的時候需要用小的手術剪將其分離，分離后的重點就在于胸腺和頸部連接的部位的處理，這個時候千萬要小心，防止出血過多。這是因為胸腺血液供應主要來自于幾條從胸腺四周穿越被膜進入小葉間隔的小動脈[8]。其血供雖然不是很豐富，但是如果不注意，沿著胸腺與頸部的連接部位隨意處理，會引起一定的出血，而兔胸腺的顏色呈粉紅色或者淡白色，著色淺而輕薄，這些出血會和胸腺組織的顏色發生變化，與周圍組織難以區分，造成接下來分離的困難。

取材完畢后，將取下的標本放置于0.9%氯化鈉溶液中，把表面的血液清洗后用濾紙擦拭干凈。接下來，用手術鑷和手術剪進行下一步的工作，因為已經發生退化的胸腺組織與縱隔脂肪組織的界限比較難以區分，如果對自己取到的組織不太確定可以用自己的雙手的拇指和食指進行揉捏感受一下它的質地，正常情況下胸腺的質地偏硬比較有韌性，而脂肪組織的質地偏軟，沒什么韌性，可以根據此對取到的標本進行進一步的確認。

綜上可知，隨著年齡增長，兔胸腺會不斷退化，有的甚至消失，并且經環磷酰胺制備的免疫抑制模型后，兔胸腺組織形態也發生明顯的不可逆的改變。