槐芩軟膏介導NF-kB信號通路對小鼠痔瘡模型肛緣水腫及創面愈合的影響*

趙俊卿 范榮榮 竇龍濤 房 磊 李少榮 彭 冀 王 茜

(1.邢臺醫學高等專科學校第二附屬醫院普外二科，邢臺 054000)(2.邢臺醫學高等專科學校第二附屬醫院藥品調劑科,邢臺 054000) (3.邢臺市內丘縣人民醫院外四科,邢臺 054000)(4.河北中醫學院,石家莊 050200)

痔瘡是一種常見的由肛管血管墊的支持結構、靜脈叢、動靜脈吻合支發生病變或下移及齒線遠側靜脈叢病理性擴張或血栓形成導致的臨床多發病[1]。痔瘡發病過程中伴隨著大量炎性細胞浸潤，形成局部炎性反應灶，引發壞死潰爛等。痔瘡主要臨床癥狀表現為肛周疼痛、瘙癢以及肛緣水腫[1-2]。目前臨床上輕度患者治療方法主要是采用藥物治療，而針對病情嚴重的內痔和混合痔患者，手術切除是常用的治療方式[3]。雖然手術治療能有效緩解病情，但是手術后肛緣水腫、疼痛以及切口愈合慢等嚴重影響患者的預后。因此，探究新型輔助痔瘡手術治療進而改善患者預后的藥物受到了廣泛關注。近些年研究表明，中藥在痔瘡的治療過程中展現較好的療效[4]。槐芩軟膏，其成分是槐角(炒)、赤芍、牡丹皮、當歸、防風、枳殼、黃芩、制川烏。具有清熱止血，消腫止痛的功效，是一種常用痔瘡治療藥物，用于Ⅰ、Ⅱ期內痔或混合痔治療。但是槐芩軟膏對痔瘡術后肛周疼痛及水腫的影響尚不得知。本研究在小鼠痔瘡模型上，探究痔術后使用槐芩軟膏治療對肛緣水腫和創面愈合的作用效果及機制，為臨床上痔術后槐芩軟膏的應用提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

10周齡雄性ICR小鼠30只(北京維通利華實驗動物有限公司)，槐芩軟膏(山東中大千方制藥有限公司，國藥準字Z20150074)；hs-CRP、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(R&D System公司)；Hemoglobin ELISA試劑盒(Abcam公司)；山羊血清(中杉金橋有限公司)；兔抗小鼠Ly6G抗體和大鼠抗小鼠F4/80抗體(Abcam公司)；兔抗小鼠IkBα、兔抗小鼠磷酸化IkBα、兔抗小鼠p65抗體、兔抗小鼠GAPDH抗體、兔抗小鼠Lamin B1抗體(Abcam公司)；ECL發光液(賽默飛世爾公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠痔瘡模型及治療方法：在30只10周齡雄性ICR小鼠肛門內0.5 cm處推注0.05 mL 20%乙酸溶液。24 h后，具有肛周腫脹、白色潰爛面現象的小鼠即為造模成功小鼠[2]，總共24只。造模成功小鼠被隨機分成兩組，即對照組和治療組，每組12只。治療組小鼠在肛周組織使用低濃度高錳酸鉀溶液清洗，然后涂抹槐芩軟膏，每日1次，連續7 d；對照組小鼠給予低濃度高錳酸鉀清洗。

1.2.2小鼠肛緣水腫及創面愈合面積評估：末次給藥24 h后，對小鼠肛緣水腫進行打分，無水腫為0分，勉強可見為1分，邊緣高于皮膚為2分，明顯腫脹為3分；創面愈合率參照參考文獻[5]測量創傷面積，并計算創面愈合率。愈合率=(原始創面面積-當前創面面積)/原始創面面積。

1.2.3ELISA檢測hs-CRP、IL-6、TNF-α 水平及hemoglobin含量：末次給藥24 h后，分別取治療組和對照組小鼠外周血及肛緣組織。采用ELISA法檢測各組小鼠血漿中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平及組織中血紅蛋白hemoglobin含量，具體方法參照hs-CRP、IL-6、TNF-α，hemoglobin ELISA試劑盒說明書。

1.2.4Real-time：PCR檢測肛緣組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平：末次給藥24 h后，取兩組小鼠肛緣組織。使用RIPA裂解液裂解組織，采用Trizol法提取組織中RNA，然后反轉錄獲得cDNA，采用qPCR小鼠肛緣組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平。IL-6 qPCR引物：上游5′-AGCCAGACGAGGCATGTT TA-3′，下游5′-TGGCTGGAGCTTGACACAAA-3′；TNF-α qPCR引物：上游5′-AGGCGGGCTAGTTAGCATTC-3′，下游5′-GGCCTTGGATGATAATGCAC-3′。

1.2.5肛緣組織HE染色和免疫熒光：末次給藥24 h后，取兩組小鼠(每組12只)肛緣組織。采用10%甲醛溶液固定組織24 h，然后將固定的組織脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片。將制備的石蠟切片進行HE染色和免疫熒光染色。取石蠟切片，脫蠟、固定，山羊血清進行封閉，然后分別使用抗Ly6G抗體和抗F4/80抗體對組織中中性粒細胞和巨噬細胞浸潤情況進行染色，洗片后再使用二抗室溫孵育1 h；DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察拍照，每個樣本選取10個視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個視野下陽性細胞面積灰度值，然后取10個視野平均值，統計每組炎性細胞所占面積。

1.2.6Western blot檢測肛緣組織IkBα及NF-kB p65水平：末次給藥24 h后，取兩組小鼠肛緣組織，使用核蛋白提取試劑盒對肛緣組織漿蛋白和核蛋白進行分離提取。收集提取液，加入蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE跑膠、轉膜，轉印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，之后抗小鼠IkBα抗體(1∶1 000)、小鼠磷酸化IkBα抗體、抗小鼠GAPDH(1∶1 000)抗體、抗小鼠NF-kB p65抗體(1∶1 000)及抗小鼠Lamin B1抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，然后使用HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h，最后加入ECL發光液曝光。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 槐芩軟膏對小鼠肛水腫及創面愈合的影響

治療7 d后，治療組小鼠肛緣水腫評分相比于對照組顯著降低，創面愈合面積及愈合率相比于對照組顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 槐芩軟膏對小鼠肛水腫及創面愈合的影響Table 1 Effects of Huaiqin ointment on anal edema and wound healing in mice

2.2 槐芩軟膏治療對小鼠外周血中炎性因子的影響

治療7 d后，治療組小鼠血漿中hs-CRP、IL-6、TNF-α水平相比于對照組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠血漿hs-CRP、IL-6、TNF-α水平變化Table 2 Changes of plasma hs-CRP, IL-6 and TNF-α levels in each group

2.3 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織中血紅蛋白以及炎性因子表達的影響

治療7 d后，結果顯示，治療組肛緣組織中血紅蛋白Hemoglobin表達水平顯著低于對照組(P<0.05)；real-time PCR顯示治療組肛緣組織中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠模型治療后肛緣組織血紅蛋白以及炎性因子水平變化Table 3 Changes of hemoglobin and inflammatory factors in anal border tissue after treatment in each group

2.4 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織病理學影響

治療7 d后，病理染色結果顯示，治療組肛緣組織中炎性細胞浸潤顯著少于對照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織病理學的影響Fig.1 Effect of Huaiqin ointment on histopathology of anal margin in mouse model

2.5 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤的影響

小鼠治療7 d后，免疫熒光染色顯示治療組肛緣組織中中性粒細胞(圖2A～B)和巨噬細胞浸潤(圖2C～D)顯著少于對照組(P<0.05)，見圖2。

注：A. 中性粒細胞免疫熒光代表圖，藍色：細胞核，綠色：中性粒細胞；B. 中性粒細胞面積定量結果；C. 巨噬細胞免疫熒光代表圖，藍色：細胞核，紅色：巨噬細胞；D. 巨噬細胞面積定量結果。與對照組比較，*P<0.01Note：A. Neutrophil immunofluorescence diagram, blue: nucleus, green: neutrophil; B. Quantitative results of neutrophil area; C. Macrophage immunofluorescence representative diagram, blue: nucleus, red: macrophage; D. Quantitative results of macrophage area. Compared with the control group,*P<0.01圖2 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織中性粒細胞和巨噬細胞浸潤的影響Fig.2 Effect of Huaiqin ointment treatment on neutrophil and macrophage infiltration in anal border tissue of mouse model

2.6 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織NF-kB信號通路的影響

小鼠治療7 d后，Western blot顯示治療組肛緣組織中IkBα磷酸化及核內NF-kB p65水平顯著少于對照組(P<0.05)，見圖3。

注：A. 組織IkBa磷酸化及核內NF-kB p65含量；B. Western blot條帶定量結果，與對照組比較，*P<0.01Note: A. Phosphorylation of tissue IkBα and nuclear NF-kB p65 content; B. Quantitative results of Western blot bands,*P<0.01 compared with the control group圖3 槐芩軟膏治療對小鼠模型肛緣組織IkBα磷酸化及核內NF-kB p65含量的影響Fig.3 Effects of Huaiqin ointment treatment on the phosphorylation of IkBα and the content of nuclear NF-kB p65 in anal border tissue of mouse model

3 討論

痔瘡是臨床常見的肛腸疾病，根據痔核發生的位置可將其分為內痔、外痔和混合痔。針對病情嚴重的痔瘡患者，手術是主要治療方式，但是手術后患者發生的肛緣水腫給患者帶來巨大的精神痛苦，且肛緣組織水腫充血嚴重減緩了手術切口的愈合、增加感染機會[6]。因此，痔術后使用合理有效藥物治療進而緩解手術引發的肛緣水腫是十分有意義的。由于肛門齒線附近的豁膜下層細小的動脈和靜脈以直接吻合方式相連接而形成洞狀靜脈，而且痔外靜脈叢與痔內靜脈叢的細小分支也是互通的，所以痔手術伴隨著對血管、淋巴管的離斷及對局部組織的機械性創傷，造成局部炎性反應，進而引發齒線附近的淋巴、血液回流受阻進而引發水腫[7-8]。因此，活血化瘀、抑制炎性反應是用于痔術后治療用藥的主要特征。

槐芩軟膏，其成分是槐角(炒)、赤芍、牡丹皮、當歸、防風、枳殼、黃芩、制川烏。本研究使用槐芩軟膏對模擬痔術小鼠模型術后肛緣水腫及創面愈合的作用效果進行研究，發現使用槐芩軟膏治療7 d后，小鼠的肛緣水腫評分和創面愈合情況相比于對照組得到顯著改善。由于水腫組織血管通透性增加，會出現血液滲出現象，血液滲出現象跟水腫嚴重程度呈正相關。因此，我們通過檢查肛緣組織中血紅蛋白含量來檢測肛緣組織水腫的嚴重程度[9]。結果發現槐芩軟膏治療能夠顯著降低肛緣組織中血紅蛋白含量，表明槐芩軟膏治療能夠顯著改善模型小鼠肛緣水腫現象。槐角具有清熱瀉火、涼血止血，黃芩瀉火解毒、止血、清熱燥濕等功效；赤芍、牡丹皮、當歸、黃芩均具有清熱涼血、活血散瘀等功效[10-12]。因此，促進肛緣組織血管血液流通可能是槐芩軟膏改善痔術后肛緣水腫的主要機制。

炎性反應在痔瘡發病過程、痔術后肛緣水腫的恢復及創面愈合過程中扮演重要角色。研究表明，痔瘡患者血清中炎性因子水平與患者痔瘡病情呈正相關[13-14]。由于手術創傷，痔術后患者機體處于炎性反應狀態，痔瘡病情本身可引起出血、感染而促發炎性反應，手術引起的創傷可進一步加劇炎性反應程度[15]。hs-CRP是急性期反應蛋白，當機體發生炎性反應或感染時會急速上升；IL-6、TNF-α是常見的炎性反應細胞因子。研究發現，在痔瘡及痔術后患者體內hs-CRP、IL-6和TNF-α顯著升高[15]。本研究發現使用槐芩軟膏治療，可以顯著降低小鼠血漿中hs-CRP、IL-6和TNF-α水平，進一步研究顯示槐芩軟膏能夠顯著減少肛緣組織中炎性細胞(中性粒細胞和巨噬細胞)浸潤并降低組織中炎性因子IL-6、TNF-α mRNA表達水平，表明槐芩軟膏治療可以降低患者痔術后體內炎性反應。NF-kB信號通路在炎性反應中扮演重要角色，其控制轉錄的DNA和細胞因子產生。靜默狀態下NF-kB分子與IkB分子結合在一起，分布在細胞漿中，當機體受到刺激后，IkB分子會發生磷酸化，磷酸化后的IkB與NF-kB分子分離，繼而NF-kB分子進入核內調控生物學活動。研究發現，NF-kB信號通路通過促進水腫組織及創面中的炎性反應，阻礙組織水腫恢復及創面愈合[16-17]。本研究發現槐芩軟膏治療顯著抑制肛緣組織中IkB磷酸化及核內NF-kB亞基p65水平，表明槐芩軟膏可能是通過抑制NF-kB信號通路抑制水腫組織的炎性反應。

綜上所述，槐芩軟膏治療能夠顯著改善小鼠痔術模型肛緣水腫，促進創面愈合，其分子機制可能是通過抑制NF-kB信號通路的激活進而抑制肛緣組織中炎性反應。本研究為槐芩軟膏在痔術后的使用提供了實驗依據。