不同遺傳背景小鼠輸卵管移植效率的研究

杜 淼 陳芳華 戰大偉

(斯貝福(北京)生物技術有限公司，北京 102101)

胚胎移植又稱受精卵移植，是指將雌性供體動物經過自然交配形成的早期胚胎或通過體外受(授)精技術獲得的早期胚胎移植進另外一只雌性受體動物體內，使之進一步產生新個體的技術[1]。胚胎移植技術的實現可以充分發揮雌性動物的繁殖能力，大大縮短了雌性動物的繁殖周期，增加了供體動物一生可繁殖的后代數量。胚胎移植技術的成功有賴于動物的生理學基礎[2]：(1)同種動物的供體和受體生殖器官的生理變化是相同的，為供體胚胎移入受體提供相同的生理環境；(2)早期胚胎在一定時間內可以處于游離狀態而不影響其質量，為胚胎的收集提供了可能；(3)受體對移入子宮的外來胚胎基本上不發生免疫排斥反應，為胚胎在受體內的存活提供可能；(4)供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯系，但供體胚胎的遺傳特性在孕育過程中不受受體子宮環境的影響。

自英國人于1890年創立胚胎移植技術以來，胚胎移植技術已成為研究受精作用、胚胎學、遺傳學以及生物凈化的重要手段。以往的研究大都集中在單一遺傳背景上，以研究封閉群居多。而本研究在不同遺傳背景小鼠的基礎上，探索胚胎數量對移植效率的影響，為從事繁育工作的科研人員提供一定的技術支持。

在本研究中，胚胎數量≤15枚時，采用輸卵管單側移植，胚胎數量為16～30枚時，采用輸卵管雙側移植。

1 材料和方法

1.1 材料

動物：本實驗所有的實驗動物均來自斯貝福(北京)生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為：SCXK(京)2019-0010, 倫理審批號：2019012302。實驗動物飼養在屏障和隔離設施中。光照明暗周期為12 h/12 h，自由飲水，自由采食。

試劑：孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin ，PMSG )注射液和人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin ，HCG )注射液(寧波第二激素廠)；M2和石蠟油(Sigma Aldrich公司)；杜氏磷酸鹽緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)(索萊寶公司)。

1.2 方法

1.2.1供體實驗動物的超數排卵：選用性成熟的供體、受體動物。第1天16:00給雌性供體動物腹腔注射PMSG 10 IU，間隔48 h后，第3天16:00腹腔注射同樣劑量的HCG。

1.2.2平衡培養液體：第4天根據超數排卵效率制作培養液滴：每個35 mm的培養基中做4個50 μL的M2液滴并覆蓋石蠟油，放置溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的培養箱中過夜平衡。

1.2.3制備假孕受體鼠：第4天15:00將結扎雄性動物與性成熟雌性動物交配，第5天早上將有陰道栓的動物挑出供移植使用。

1.2.4收集胚胎：第5天將供體動物經75%乙醇消毒后取出輸卵管(此過程需有兩套手術鑷和手術剪，一套用于剪開皮膚，一套用于收集輸卵管，避免交叉污染)，利用DPBS沖洗液將胚胎從輸卵管中沖出，利用撿卵針將胚胎移入經過平衡的M2培養液中。收集完所有胚胎準備移植。

1.2.5數據記錄：記錄每只受體動物的移植胚胎數與出生數量，計算產仔率。

2 結果

2.1 封閉群動物移植不同胚胎數量對產仔率的影響

就KM來講，每只妊娠母鼠平均產仔率最高(52.6%)的移植胚胎數量是16～30枚，而ICR移植相同的胚胎數量平均產仔率(32.0%)則最低。ICR平均產仔率最高的移植胚胎數為11～15枚。同時，KM單側移植的產仔率低于ICR，而雙側移植的產仔率則優于ICR。

表1 KM和ICR小鼠移植不同胚胎數量對移植效率的影響Table 1 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in KM and ICR

2.2 近交系動物移植不同胚胎數量對產仔率的影響

本實驗小鼠移植胚胎數量≤15枚，C57BL/6J采用輸卵管單側移植方式，由表中結果可看出，輸卵管單側移植時，C57BL/6J的平均產仔率在50%左右(表2)。

表2 C57BL/6J小鼠移植不同胚胎數量對移植效率的影響Table 2 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in C57BL/6J

2.3 免疫缺陷動物移植不同胚胎數量對產仔率的影響

從免疫缺陷嚴重程度來講，NOD-SCID的免疫缺陷程度比BALB/c-nu更為嚴重。由表3可看出，NOD-SCID具有移植胚胎數量的依賴性，當移植數量過少時，如≤10枚胚胎時，小鼠的平均產仔率為0。

表3 BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠移植不同胚胎數量對移植效率的影響Table 3 Effect of different embryos transplanted on transplantation efficiency in BALB/c-nu and NOD-SCID

3 討論

本研究分別選用封閉群KM和ICR、近交系C57BL/6J以及免疫缺陷模型鼠NOD-SCID和BALB/c-nu為研究對象。結果發現不同遺傳背景動物之間移植效率有所不同。在保證胚胎質量和受體鼠生理狀態完好的情況下，KM、ICR、C57、BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠的最大產仔率分別是64%、73%、73%、50%和63.5%。

但是，本研究的數據與其他學者的數據會有所不同。如參考文獻[3]中提到每只KM小鼠移植胚胎數量為15枚時，產仔率為16.6%；當移植胚胎數量為25枚時，產仔率為36%。不難發現，隨著移植胚胎數量的增加，小鼠的平均產仔率也隨之增加，這和本研究的實驗結果是相一致的。

不同研究者實驗結果不同的原因可能是由于胚胎質量引起的：有研究顯示，超數排卵得到的胚胎質量比自然排卵的質量要差；同時，小鼠的移植方式也是造成移植效率不同的原因：如在C57BL/6J小鼠上，輸卵管雙側移植效率略高于單側移植效率，但無顯著性差異[4]。胚胎質量、胚胎來源(鮮活胚胎/冷凍胚胎)、胚齡、受體動物的身體素質、生殖器官疾病(卵巢囊腫、子宮膿脹等)等均會影響移植效率，但是在胚胎移植過程中,移植的胚胎數量也是影響移植效率的重要因素[5-7]。為了提高實驗動物的移植效率，本研究對實驗動物移植胚胎數目與獲得的仔鼠數目進行統計，從而分析出合適的移植胚胎數量，優化移植效率。本研究的實驗結果確定了不同背景小鼠移植胚胎數量的最佳值，即：KM小鼠最佳移植胚胎數范圍是16～30枚；ICR小鼠最佳移植胚胎數范圍是11～15枚；C57小鼠最佳移植胚胎數范圍是11～15枚；BALB/c-nu小鼠最佳移植胚胎數范圍是≤10枚；NOD-SCID小鼠最佳移植胚胎數范圍是11～15枚。根據本研究結果提示，當剩余胚胎數量較少時，可以采取胚胎冷凍的方法將胚胎儲存，可有效的減少胚胎和假孕鼠的浪費。本研究成果可以提高同等技術條件下的胚胎移植效率，使早期胚胎得到最大程度的利用，保護優質的種子資源，為生物凈化等工作者提供了切實可行的移植方法，具有一定的實際應用價值。