不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤小鼠P21、P53、P13K及PKB/Akt蛋白表達的影響*

朱喜春 張永興 俞發榮

(1.甘肅省藥品檢驗研究院，蘭州 730070)(2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046) (3.甘肅政法大學公安分院，蘭州 730070)

人類疾病實驗動物模型在生物科學、醫藥化學和生命健康等領域得到了廣泛的應用[1]，是研究疾病的發生、發展和病理機制的有效工具[2]。嚴重聯合免疫缺乏(severe combined immune deficiency,SCID)小鼠因缺乏腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)導致B細胞、T細胞功能缺失，從而表現出嚴重的聯合免疫缺陷癥狀。SCID小鼠是繼裸鼠(免疫缺陷動物、先天無胸腺和缺乏T淋巴細胞)出現之后，人類發現的又一種十分有價值的免疫缺陷動物。SCID小鼠已應用于人類免疫學、腫瘤學、生理學、藥理學等方面的研究，能接受人體腫瘤組織的移植，進行人體腫瘤學方面的實驗研究。研究證明，高等動物乃至人類組織細胞的正常生長受到不同信號傳導系統的調控，其中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號傳導通路與細胞分裂增殖關系尤為密切[3]。 有研究[4]發現，細胞生長或抑制受PI3K-Akt信號傳導通路的調節和控制，PI3K-Akt信號傳導通路在細胞內發揮重要的作用,參與了許多生理和病理活動。體外研究顯示，采用PI3K-Akt信號傳導通路抑制劑可以逆轉腫瘤細胞的耐藥性[5]和提高抗腫瘤藥物的藥效[6],PI3K-Akt信號傳導通路可能是腫瘤治療的潛在靶點[7]。為了探索不飽和脂肪酸對腫瘤增殖的抑制作用及PI3K-Akt信號傳導通路調控作用機制，將甘肅貓兒眼(euphorbia kansui)不飽和脂肪酸給予荷肝癌組織的SCID小鼠，探索不飽和脂肪酸對肝癌增殖的抑制作用，為不飽和脂肪酸進一步研究開發和臨床應用提供理論依據，為預防和治療腫瘤探索新的作用靶點，提供新的藥物資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SCID小鼠50只,雌雄各半，體質量 20～22 g，來源中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心【SCXK (甘)2020-0002】。全部實驗在甘肅省藥品檢驗研究院實驗動物實驗室【SYXK (甘)2020-0006】完成。動物實驗通過甘肅省藥品檢驗研究院動物倫理委員會審核批準(GYJY-2021-006)，對動物實驗進行了科學合理的設計,優化實驗,遵守“3R”原則。從動物的購買、運輸,動物使用過程中規范飼養管理,善待動物,規范實驗操作技術,動物實驗結束采用安樂死,讓動物在整個實驗過程中享受人文關懷。

1.1.2肝癌組織：甘肅省腫瘤醫院腫瘤外科提供。肝癌組織來源：患者男性，56歲，HCC/Ⅲa/T3N0M0，Child-Pugh A/B， PS 0～2。所有患者知情同意。

1.1.3試劑與儀器：不飽和脂肪酸(蘭州大學天然植物研究所)，甘肅貓兒眼(euphorbia kansui)塊根(中國科學院蘭州化學物理研究所); 5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海旭東海普藥業有限公司)；抗癌基因P53、磷酸肌醇3激酶(P13K)、 細胞周期素依賴性激酶抑制因子(P21)、蛋白激酶B(PKB/Akt)試劑盒(上海生物科技開發公司)。

1.2 方法

1.2.1肝癌組織移植：選取8周齡SPF級SCID小鼠50只，雌雄各半。全部動物在SPF級實驗室獨立送回風凈化籠具(individal ventilation cages,IVC)飼育盒內飼養，自由飲水進食，人工光照 12 h。實驗室溫度20～22 ℃，IVC內溫度 22.2 ℃，濕度55%～65%，適應7 d。將手術切取2 h內肝癌組織放入超凈臺中，用Hanks液反復沖洗，剔去壞死組織和非癌組織后，將瘤組織切成1～2 mm3小塊，用粗針穿刺移植于SCID小鼠右側腋窩皮下，IVC飼育盒中飼養。

1.2.2荷瘤 SCID 小鼠分組和給藥 ：按照預實驗方法，待移植瘤長到6～7 mm時，荷肝癌組織的 SCID 小鼠隨機分為5組，每組 10只。根據人體用藥量和小鼠體表面積換算，計算得出不飽和脂肪酸給藥量為：低、中、高劑量組腹腔注射不飽和脂肪酸50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)和200 mg/(kg·d);五氟尿嘧啶(5-FU)組腹腔注射5-FU 100 mg/(kg·d)，模型組腔注射蒸餾水2 mL/(kg·d)，連續給藥21 d。

1.2.3腫瘤組織檢測分析：末次給藥后次日乙醚吸入無痛麻醉，手術切開腫瘤周圍皮膚，剝取腫瘤組織，用游標卡尺測量移植瘤長(a)、寬(b)和高(c),用體積計算公式V=πabc/6[8]計算移植瘤體積，用天平稱移植瘤質量，比較腫瘤生長情況。用萬分之一分析天平稱取各組瘤組織500 mg，用勻漿研磨器研磨，以 2 000 r/min 離心 15 min，取上清，用酶標儀在 450 nm 波長下測定吸光度(A)。

1.2.4直線回歸方程制作：取標準品 50 μL，加入酶標板，用酶標儀在 450 nm 波長下測定吸光度(A)。以標準品的濃度為橫坐標，對應的吸光度(A)為縱坐標，制作出標準曲線的直線回歸方程。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SCID小鼠腫瘤模型建立及不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響

將肝癌組織分別移植于50只SCID小鼠右側腋窩皮下，肝癌組織生長正常，腫瘤模型建立成功。將不飽和脂肪酸和5-FU給予荷肝癌組織的 SCID 小鼠，第22天比較各組動物移植瘤生長情況，見圖1；不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤體積和質量顯著小于模型組(P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤體積和質量與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤體積和質量顯著小于5-FU組(P<0.01)，見表1。

表1 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響Table 1 Effect of unsaturated fatty acids on the growth of liver cancer transplanted n=10)

2.2 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤蛋白表達水平的影響

2.2.1不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P53蛋白表達水平的影響：以P53標準品的濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作標準曲線的直線回歸方程,見圖2。

注: A：正常組；B：不飽和脂肪酸低劑量組；C：不飽和脂肪酸中劑量組；D：不飽和脂肪酸高劑量組；E：5-FU組;F：模型組Note: A： normal group; B：unsaturated fatty acid low dose group; C： unsaturated fatty acids medium dose group;D： unsaturated fatty acid high dose group; E：5-FU group; F：model group圖1 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤生長的影響Fig.1 Effects of unsaturated fatty acids on the growth of liver cancer transplanted tumor

圖2 P53標準曲線的直線回歸方程Fig.2 Linear regression equation of P53 standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P53蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01)，見圖3。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖3 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P53蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P53 protein in liver cancer transplantation tumor

2.2.2不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P21蛋白表達水平的影響：以P21標準品的濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作標準曲線的直線回歸方程,見圖4。

圖4 P21標準曲線的直線回歸方程Fig.4 Linear regression equation of P21 standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P21蛋白表達水平顯著高于5-FU組(P<0.01)，見圖5。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖5 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P21蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P21 protein in liver cancer transplantation tumor

圖6 P13K標準曲線的直線回歸方程Fig.6 Linear regression equation of P13K standard curve

2.2.3不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平的影響：以P13K標準品的濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作標準曲線的直線回歸方程,見圖6。

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01),見圖7。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01；Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖7 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤P13K蛋白表達水平的影響Fig.7 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of P13K protein in liver cancer transplantation tumor

2.2.4不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平的影響：以PKB/Akt標準品的濃度為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標作標準曲線的直線回歸方程,見圖8。

圖8 PKB/Akt標準曲線的直線回歸方程Fig.8 Linear regression equation of PKB/Akt standard curve

與模型組相比，不飽和脂肪酸低、中、高劑量組和5-FU組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，不飽和脂肪酸低、中劑量組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平與5-FU組無明顯差異(P>0.05)，高劑量組肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平顯著低于5-FU組(P<0.01),見圖9。

注：與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01；與5-FU組相比, #P<0.01Note：Compared with model group, *P<0.05,**P<0.01; Compared with 5-FU group, #P<0.01圖9 不飽和脂肪酸對肝癌移植瘤PKB/Akt蛋白表達水平的影響Fig.9 Effect of unsaturated fatty acids on expression level of PKB/Akt protein in liver cancer transplantation tumor

3 討論

嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠已廣泛用于膀胱癌[10]、皮膚瘢痕[11]、食管癌[12]、肝癌[13]、乳腺癌[14]、結腸癌[15]等疾病發生、發展、轉移和預防治療的實驗研究。不飽和脂肪酸作為被廣泛研究的免疫營養物質,不僅在調節機體免疫功能、脂質代謝等方面有著重要作用,而且在腫瘤預防和治療方面也有著重要作用。研究表明,不飽和脂肪酸具有誘導多種腫瘤細胞凋亡[16]、抑制腫瘤細胞增殖[17]、轉移[18]等作用，并能抑制相關癌癥基因編碼蛋白表達[19]，調控信號傳導通路[20]，降低癌細胞的侵襲力[21]，從而起到抗腫瘤的作用[22]。研究發現，腫瘤生長或抑制受PI3K/Akt信號通路的調節和控制[23]。PI3K-Akt信號通路在腫瘤血管生成和細胞生長、增殖、新陳代謝、遷移、分化和凋亡過程中起著至關重要的作用[24]。PI3K-Akt 信號通路被激活時，促進腫瘤細胞增殖[25]，PI3K-Akt 信號通路被抑制時，促進腫瘤細胞凋亡，發揮其抗腫瘤效應[26]。在PI3K-Akt信號傳導通路中，p53、p21基因起著重要的調控作用。在正常生理條件下，體內外環境因子與細胞膜受體結合，激活p53基因使之表達，P53蛋白與p21基因直接作用調控P21蛋白的表達[27],促使P21與二磷酸鳥苷(Guanosine diphosphate，GDP)分離而與三磷酸鳥苷 (Guanosine triphosphate, GTP)結合，形成P21-GTP復合體，使細胞內信號傳導系統開放，細胞開始分裂和增殖；P21具有GTP酶活性，可水解GTP為GDP，P21與GDP結合而失活，使細胞內信號傳導系統處于關閉狀態，調控正常的細胞分裂增殖。實驗結果發現，給予荷人肝癌SCID 小鼠不飽和脂肪酸，肝癌移植瘤生長受到抑制；P53、P13K和PKB/Akt水平下調,從而降低P13K-Akt信號通路活性及下游相關分子的表達，抑制瘤細胞的增殖；P21水平升高,水解GTP為GDP，P21與GDP結合而失活，關閉細胞內信號傳導系統。這與文獻[28-29]結果一致。實驗結果提示，在P13K-Akt信號傳導通路中，p21、P53、P13K和PKB/Akt蛋白水平起著主要的調控作用，可作為臨床腫瘤治療的潛在靶點。