微生物發酵轉化皂苷類化合物機制的研究進展

李 倩，于 丹，國立東，都曉偉

微生物發酵轉化皂苷類化合物機制的研究進展

李 倩，于 丹，國立東，都曉偉*

黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040

皂苷類化合物是天然藥物中存在的一類重要化學成分，通過微生物技術可以將其轉化為多種衍生物，常用的微生物主要為細菌和真菌，轉化反應以水解脫去糖基為主，來提高轉化產物的生物利用度和藥理活性。此外，通過羥基化、糖基化、羰基化和酯化等反應，能夠降低底物的不良反應，改善藥物功效。甾體皂苷的微生物轉化主要以皂苷與皂苷元之間的相互轉化為主，是實現某些特殊皂苷類化合物規模化生產的有效途徑。以人參皂苷、甘草次酸、黃芪皂苷、薯蕷皂苷、知母皂苷等為例，分析并闡述皂苷類化合物的微生物發酵轉化機制，以期為皂苷類成分生物合成及新藥研究開發提供參考。

微生物發酵；三萜皂苷；甾體皂苷；人參皂苷；甘草次酸；黃芪皂苷；薯蕷皂苷；知母皂苷；生物轉化；機制

皂苷類化合物是藥用植物重要的活性成分，廣泛存在于黃芪、黃精、三七、桔梗、人參、甘草、柴胡、知母、靈芝等中藥材中，具有保護心臟、增強免疫、抗炎、抗病毒等藥理作用。作為高相對分子質量的兩親化合物，皂苷由親脂的皂苷元和親水的糖鏈部分組成[1]，根據苷元結構的不同，其可劃分為三萜皂苷和甾體皂苷，三萜皂苷的苷元由30個碳原子組成，甾體皂苷的苷元由27個碳原子組成。根據連接糖鏈數目不同，其分為單糖鏈皂苷、雙糖鏈皂苷及三糖鏈皂苷，也有在糖鏈末端通過酯鍵連接其他基團的結構。由于相對分子質量大，膜通透性差，皂苷的體內生物利用度低，但可以通過斷掉部分糖鏈等方法轉化成小分子化合物來促進吸收，亦可通過生物轉化方法進行結構修飾，以提高藥物的吸收利用，增強藥物的作用[2]。

微生物轉化是利用微生物發酵藥物，通過微生物產生的酶及酶系產物等催化藥物部分成分發生特定的化學反應，進行結構修飾獲得新的化合物或其他藥物成分。微生物在發酵過程中可以利用藥物中多糖、纖維、蛋白質等成分獲取養分，藥物中低活性有效成分被轉化為高活性有效成分。研究表明，微生物轉化具有反應特異性強、副產物少、條件溫和、對環境友好等優點，且微生物繁殖能力強、生長周期短、適應能力好，微生物發酵轉化技術被廣泛應用于天然藥物合成及結構修飾，以達到減毒增效的目的[3]。

1 微生物轉化三萜皂苷

三萜皂苷通常是指骨架由30個碳原子組成的萜類化合物，一般是皂苷元與糖類結合或游離于植物中。三萜皂苷具有廣泛的藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗過敏等，被應用于多種疾病的治療，在人參、甘草、黃芪等藥用植物中含量較高，作為主要成分發揮藥效。

1.1 人參皂苷

人參皂苷是五加科植物人參C. A. Mey.、西洋參L.、三七(Burk.) F. H. Chen等藥材中的主要活性成分，具有抗衰老、抗炎、抗老年癡呆、抗腫瘤、抗抑郁、抗心肌缺血、抗氧化、增強免疫等生物活性[4]。迄今為止，已報道180多種人參皂苷，并有60多種皂苷結構被確定，包括含量較高的主要人參皂苷和含量極少的稀有人參皂苷。人參皂苷主要包含人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1等，稀有人參皂苷包含人參皂苷Rh1、Rh2、CK、Rh4、Rk1、Rg3、Rg5、Rk3等。眾多學者發現，稀有皂苷具有更高的藥用價值，開發潛力大，因而將主要人參皂苷轉化為稀有人參皂苷是多年來研究的熱點[2]。近年來，對人參皂苷微生物轉化的報道較多，挖掘出了一定量的發酵菌株，其轉化途徑及發酵菌種情況見表1和圖1。

微生物發酵轉化人參皂苷的過程，主要依賴于微生物所產生的一系列酶系產物，如β-葡萄糖苷酶、α--阿拉伯呋喃糖苷酶、α-鼠李糖苷酶等，這些酶主動水解人參皂苷中的糖基，促使人參皂苷發生轉化。

發酵過程中的主要作用酶是β-葡萄糖苷酶，但不同微生物來源的β-葡萄糖苷酶對糖苷鍵的水解作用不同，其水解的原因尚不明確。若轉化人參皂苷Rb1時，對C-20位糖基選擇性更高，則水解外側1分子葡萄糖獲得中間產物人參皂苷Rd，如冬蟲夏草菌、錐毛殼菌、伯克霍爾德菌GE17-7、長柄木霉、黑曲霉J7、副干酪乳酪桿菌堅韌亞種等；若對C-3位糖基選擇性更高，則獲得中間產物絞股藍皂苷ⅩⅤII[17]，如類消化乳桿菌LH4。中間產物人參皂苷Rd的C-20、C-3位仍然存在糖基，因此β-葡萄糖苷酶能繼續催化其生成不同的產物。對C-3位糖基選擇性更高，則生成人參皂苷F2，如冬蟲夏草菌、裂褶菌、黑曲霉J7等；若對C-20位糖基選擇性更高，則生成產物人參皂苷Rg3，如伯克霍爾德菌GE17-7、長柄木霉、副干酪乳酪桿菌堅韌亞種等。裂褶菌、黑曲霉J7等菌株的β-葡萄糖苷酶可以繼續水解使人參皂苷F2生成稀有人參皂苷CK。來自副干酪乳酪桿菌堅韌亞種MJM60396的β-葡萄糖苷酶可以繼續水解人參皂苷Rg3中C-3位的1分子葡萄糖，獲得終產物人參皂苷Rh2[16]。吳秀麗等[9]從人參根際分離并篩選出了1株真菌黑曲霉SRS-69，其發酵過程中產生的β-葡萄糖苷酶同樣可以水解人參皂苷Re的C-20位糖基產生人參皂苷Rg2，并可以水解人參皂苷Rg1的C-3位糖基和人參皂苷Rf的C-6位糖基生成人參皂苷Rh[17]。

表1 人參皂苷微生物轉化途徑及發酵菌種

圖1 人參皂苷的微生物轉化途徑

發酵過程中的次要作用酶為α-鼠李糖苷酶和α--阿拉伯呋喃糖苷酶。α-鼠李糖苷酶專注于水解人參皂苷C-6位外側的鼠李糖基。黑曲霉SRS-69發酵轉化人參皂苷Re、Rg2，其中α-鼠李糖苷酶水解人參皂苷Re和Rg2C-6位的鼠李糖基分別產生人參皂苷Rg1、Rh1[9]；來自茅臺酒曲的水棲纖維微菌Lyp51發酵轉化人參皂苷Rc，產生的α--阿拉伯呋喃糖苷酶作用于人參皂苷Rc C-20位的阿拉伯呋喃糖苷鍵，生成終產物人參皂苷Rd。

1.2 甘草皂苷

甘草皂苷是豆科植物甘草Fisch.中發揮藥理作用的主要成分，目前分離出甘草皂苷20余種，皂苷結構一般是以3β-羥基齊墩果烷型五環三萜為苷元，連接2分子葡萄糖醛酸為主構型，具有保肝、抗病毒、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗癌、抗哮喘、抗過敏等藥理活性[18-20]。同樣為三萜皂苷，甘草皂苷像人參皂苷一樣，結構中糖鏈的多少直接影響其藥理作用和生理功能，可通過水解反應去除部分或全部糖基來提高或改變其藥理作用。微生物發酵轉化主要是以甘草酸和甘草次酸為底物，探究其轉化途徑及機制。

1.2.1 甘草酸 其是從傳統中藥甘草根部提取出來的一種三萜類化合物，不僅可以作為天然的食品添加劑，還具有抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗炎等多種藥理活性[19]，在臨床上應用于支氣管炎、肝炎等的治療，同時也用于疾病的輔助治療，如可緩解新型冠狀病毒肺炎患者的炎癥反應等。甘草酸雖藥理作用較廣，但其結構中含有2分子葡萄糖醛酸，極性較大，不易透膜，且具有首關效應[20]，導致生物利用度低，故可以通過去除葡萄糖醛酸基團來提高其生物利用度，并且不減弱藥理活性。多年以來，人們對甘草酸微生物發酵轉化的相關研究頗多，發現了許多轉化菌種，但甘草酸的轉化途徑比較簡單，基本概括為甘草酸→甘草次酸、甘草酸→單葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG）。

用于微生物轉化的菌株一般于發酵過程中產生β--葡萄糖醛酸苷酶，不同來源的β--葡萄糖醛酸苷酶對糖苷鍵的水解作用具有立體選擇性，一部分水解掉甘草酸的1分子葡萄糖醛酸得到單葡萄糖醛酸甘草次酸，另一部分則可以水解2分子葡萄糖醛酸得到甘草次酸。GAMG因只含有1分子葡萄糖醛酸，極性介于甘草酸和甘草次酸之間，具有很好的跨膜運輸能力，溶解度較高，生物利用度增大。

研究表明，GAMG的甜度比甘草酸高5倍，可作為牛奶飲品、飲料、湯料等食品的添加劑[21]，增加食品風味，也可作為遮蓋其他腥味、苦味等的去苦劑。在藥理作用方面，楊永安[22]通過動物實驗發現甘草酸衍生物在抗腫瘤活性上差異較大，β構型化合物的活性比α構型更弱，二糖結構的化合物活性比單糖化合物的更弱，顯而易見，18α-GAMG具有比甘草酸和甘草次酸更高的抗腫瘤活性，相對安全且不良反應較小，特別是對于肝癌有更好的效果，是潛在的抗肝癌新藥成分。微生物轉化途徑及發酵菌株見表2和圖2。

表2 甘草酸微生物轉化途徑及發酵菌株

A～R代表不同發酵菌株，同圖2

A—R represents different fermentation strains, same as fig. 2

圖2 甘草酸的微生物轉化途徑

1.2.2 甘草次酸 其是甘草酸三萜苷元成分，藥理作用包括抗病毒、保肝、抗癌等，可通過抑制炎癥因子的產生以及調節相關通路來降低炎癥反應，主要作用部位在肝臟[35]。對于一些原癌細胞或能夠引發惡性腫瘤的病毒均有抑制作用，如艾滋病毒、肝炎病毒等，但甘草次酸具有醛固酮樣活性，易導致低血鉀、高血壓、水腫等不良反應，且極性小，高濃度時容易產生毒性，所以對其進行結構修飾來改善溶解性以及減輕不良反應[36]。甘草次酸的結構改變是在特定位點進行的化學反應，如羥基化、羰基化、糖基化、乙酰化、酯化等，羥基化反應發生在C-1、C-6、C-7、C-15、C-24、C-27位，羰基化主要發生在C-3和C-7位，糖基化主要出現在C-3和C-30位上，乙酰化只發生在C-3位，酯化只發生在C-7與C-27位之間并成環。甘草次酸微生物轉化產物及發酵菌種見表3和圖3。甘草次酸本身無神經保護活性，但當C-3位無羰基化時，C-7位羥基化、C-15位羥基化、C-7位和C-15位同時羥基化時，神經保護活性會顯著增強。

1.3 黃芪皂苷

黃芪皂苷是豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge主要活性成分之一，包括黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III、黃芪甲苷等[46]，藥理作用廣泛，如抗病毒、抗哮喘、抗炎、抗纖維化、抗氧化、調節免疫功能等，黃芪皂苷在黃芪的研究中占有舉足輕重的位置，盡管目前國內關于黃芪微生物發酵方面的研究并不十分豐富，但均極具代表性，可以通過優化皂苷結構而得到新的化合物，從而降低不良反應，提高藥理活性。

1.3.1 真菌發酵 阮鳴[47]使用香菇(Berk.) Pegler、靈芝(Leyss. ex Fr.) Karst、姬松茸Murill和桑黃(L. ex Fr)等不同的藥（食）用真菌發酵黃芪，發現均可以將黃芪甲苷轉化成異黃芪甲苷。并推測其轉化機制為靈芝菌發酵過程中所產生的某種木糖苷酶水解黃芪甲苷的1分子木糖后將其轉化成異黃芪甲苷。

劉曉會[48]篩選出了1種能夠從黃芪總皂苷中高效轉化出黃芪甲苷的菌株傘枝犁頭霉AS2，在黃芪總皂苷中鑒定出4個可以轉化為黃芪甲苷的化合物，分別為黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、異黃芪皂苷I、異黃芪皂苷II，這4個化合物與黃芪甲苷的區別就是結構上多了1個或2個乙酰基，因此揭示了傘枝犁頭霉中含有黃芪皂苷去乙酰化酶，并且此酶對底物的專一性較差，繼而驗證了4個前體化合物轉化為黃芪甲苷的具體途徑：黃芪皂苷I→（異黃芪皂苷II、黃芪皂苷II）→黃芪甲苷、黃芪皂苷II→黃芪甲苷、異黃芪皂苷I→黃芪皂苷II→黃芪甲苷、異黃芪皂苷II→黃芪皂苷II→黃芪甲苷。黃芪甲苷的抗病毒、抗癌、抗糖尿病、抗心肌損傷等作用使其開發成為臨床新藥，解決了化學合成方法較為復雜且困難的問題。

1.3.2 細菌發酵 Wang等[49]從土壤中分離并篩選出了一株芽孢桿菌LG-502sp. LG-502，并推測其對黃芪甲苷的轉化途徑為黃芪甲苷→ cyclogaleginoside B→環黃芪醇，芽孢桿菌中的葡萄糖苷酶和木糖苷酶在此途徑中發揮了主要作用，由于2種酶存活的最適溫度、最適pH等條件不同，葡萄糖苷酶在芽孢桿菌的培養條件下比木糖苷酶活性更高，所以黃芪甲苷優先脫掉1分子葡萄糖，其次脫掉1分子木糖，得到環黃芪醇。黃芪甲苷結構中含有糖基，極性較大，影響生物利用度，而脫掉2分子糖基后的環黃芪醇具有良好的膜通透性，并且環黃芪醇可以激活端粒酶，達到抗衰老、增強免疫力等功效[50]，在臨床醫藥中應用廣泛。

表3 甘草次酸微生物轉化產物及發酵菌株

a～j代表不同發酵菌株，同圖3

a—j represents different fermentation strains, same as fig. 3

圖3 甘草次酸微生物轉化途徑[45]

黃芪皂苷微生物發酵轉化途徑見圖4。

圖4 黃芪皂苷微生物轉化途徑

人參、甘草、黃芪的三萜皂苷生物轉化中微生物以真菌居多，反應機制以水解反應為主，通常發生在C-3、C-6、C-20位等，脫掉糖基，既能提高生物利用度，也能選擇性增強抗癌、抗病毒、抗炎等藥理活性；除了水解反應，還包括去乙酰化、羥基化、糖基化、羰基化、乙酰化等反應，具體發生在C-1、C-6、C-7、C-15、C-24、C-27位等，降低底物的不良反應，改善功效，有利于藥物的研究和開發。

2 微生物轉化甾體皂苷

甾體皂苷是以螺甾烷類化合物與糖基結合的甾體苷類，基本母核由27個碳原子構成，并且結構中具有6個環，為螺甾烷衍生物。較早以前，甾體皂苷已經成為激素類以及甾體避孕藥等的原料，后期臨床中開發出了多種新藥，在治療心絞痛、心肌缺血、糖尿病、心臟病等方面有明顯成效，應用甚廣。甾體皂苷多存在于單子葉植物中，雙子葉植物中非常少，在穿山龍、黃精、重樓、知母等藥用植物中常見[51]。

2.1 薯蕷皂苷

甾體皂苷微生物轉化中比較典型的代表為薯蕷皂苷。薯蕷皂苷主要存在于薯蕷科植物黃山藥Prain et Burk.、穿龍薯蕷Makino和盾葉薯蕷C. H. Wright中，具有抗癌、降血糖、調血脂、抗氧化等作用[52]，并且仍然作為合成甾體避孕藥物以及部分激素類藥物的重要原料，但薯蕷皂苷脂溶性較大，生物利用度不高，對薯蕷皂苷進行一定的結構優化和修飾，可提高其生物利用度和藥效作用。

2.1.1 真菌發酵 劉琳[53]發現盾葉薯蕷中含量較多的甾體皂苷為薯蕷皂苷和盾葉新苷，利用哈茨木霉可將這2種成分轉化成薯蕷皂苷元，并且苷元得率較高，轉化途徑見圖5。發酵過程中，哈茨木霉所分泌的纖維素酶可破壞盾葉薯蕷的細胞壁，使皂苷類成分釋放出來，盾葉新苷在葡萄糖淀粉酶作用下脫掉鼠李糖基，繼而被胞外β-葡萄糖苷酶水解掉葡萄單糖得到延齡草次苷，延齡草次苷進入菌體胞內，促使哈茨木霉產生胞內β-葡萄糖苷酶，進而水解掉延齡草次苷末端的葡萄二糖，最終生成薯蕷皂苷元。如果利用米曲霉CICC 2436[54]轉化2種薯蕷皂苷，主要是α--鼠李糖苷酶、β--葡萄糖苷酶以及外切-1,4-β--葡萄糖苷酶發揮水解作用，并且鼠李糖的水解速度比葡萄糖水解速度快，先水解掉鼠李糖，再從末端逐個水解掉葡萄糖得到薯蕷皂苷元，因此盾葉新苷不能轉化成為薯蕷皂苷。Zheng等[55]采用里氏木霉發酵轉化盾葉薯蕷皂苷為薯蕷皂苷元，而延齡草次苷是中間產物，相關酶首先水解掉外側的鼠李糖，再裂解葡萄糖苷鍵，去掉所有糖鏈獲得苷元[56]，此菌轉化薯蕷皂苷元的效率可達90%。郭夢真[57]篩選出的1株塔賓曲霉，可以將薯蕷皂苷先轉化為延齡草次苷，再轉化為薯蕷皂苷元，并揭示了塔賓曲霉先水解掉外側鼠李糖，后水解葡萄糖的規律。薯蕷皂苷元與其他薯蕷皂苷衍生物不同的是，沒有側鏈或糖鏈，苷元是發揮藥理作用的中心結構，所以薯蕷皂苷元比其他多側鏈衍生物的藥效更強一些。

利用從穿龍薯蕷中提取分離的少根根霉原變種var.發酵穿龍薯蕷藥液，可使薯蕷皂苷元含量增加，此菌株能夠高效轉化薯蕷皂苷，且提高薯蕷皂苷元的提取率[58]。一方面菌株發酵過程中產生的生物酶會使藥液中的細胞壁破裂，薯蕷皂苷元破壁而出，從而提高了苷元提取率；另一方面菌株發酵所產生的淀粉酶能夠斷裂糖苷鍵，導致藥材中的薯蕷皂苷脫掉糖鏈，轉變成苷元。陳宇[59]從盾葉薯蕷根部篩選出3株菌，均能將薯蕷皂苷轉化為薯蕷皂苷元，分別是米曲霉GIM 3GIM 3、No.2.20140425和泡盛曲霉，它們的轉化機制大體相同，也是通過產生糖苷酶，逐步水解糖鏈得到次級苷以及苷元。經篩選及優化，發現No.2.20140425和泡盛曲霉混合發酵后的轉化率最高，達到71.57%。

吳廣畏[60]發現真菌雜色云芝(L.) Fr.可以發酵轉化薯蕷皂苷元，轉化途徑見圖6，由細胞色素P450單加氧酶系催化生成5個產物，首次發現薯蕷皂苷元C-21位甲基可以被羥基化，并且在C-7、C-12、C-15位都可以羥基化，據推測，5個產物應該是由不同的細胞色素P450氧化酶催化而成。

圖5 薯蕷皂苷的微生物轉化途徑

圖6 雜色云芝發酵轉化薯蕷皂苷元的途徑

有報道利用刺孢小克銀漢霉CGMCC 3.2716的靜息細胞發酵轉化薯蕷皂苷元，得到4種代謝物，并推測出了1個中間產物（化合物I）[61]，見圖7，研究發現該菌會產生不同的細胞色素P450單加氧酶，一種酶可以只催化C-7位羥基化，一種酶可以催化C-7位或C-11位發生羥基化，還有一種酶可以催化C-7位或C-12位發生羥基化，其中的脫氫酶通過中間產物促使C-11位羥基脫氫成酮，但由于反應速度過快，只能測到最終產物(25)-spirost-5-ene-3β,7β-diol-11-one。

圖7 刺孢小克銀漢霉發酵轉化薯蕷皂苷元的途徑

全波等[62]培養米曲霉AS3.951來發酵轉化原薯蕷皂苷。米曲霉既可以先水解原薯蕷皂苷C-3位外側的一分子鼠李糖基生成26--β-glucopyranosyl(25)-22-hydroxy-5-ene-furostane-3β,26-diol-3--[α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-2），并且其他位置不發生變化；也可以將C-20位羥基還原成雙鍵形成26--β-glucopyranosyl(25)-5,20 (22)-dienefurostane-3β,26-diol-3--[(α-rhamnopyranosyl)- α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-3）和26--β-glucopyranosyl(25)-5,20(22)-diene-furostane-3β,26-diol-3--[α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-4）；還可以繼續斷裂C-26位糖鏈形成diosgenin-3--[(α-rhamnopyranosyl)-α-rhamnopyranosyl]-β-glucopyranoside（8-5）和diosgenin-3--[α-rhamnopyranosyl]- β-glucopyranoside（8-6）。崔乃菠等[63]利用酵母菌發酵菊葉薯蕷，將原薯蕷皂苷轉化成薯蕷皂苷，通過工藝優化達到富集薯蕷皂苷的目的，并推測轉化途徑見圖8，原薯蕷皂苷屬于呋甾皂苷，薯蕷皂苷屬于螺甾皂苷，呋甾皂苷上的糖鏈比螺甾皂苷的多，且水溶性較高，研究表明，C-26位的糖苷鍵比C-3位的糖苷鍵更容易斷裂，故通常呋甾皂苷水解掉C-26位糖苷鍵轉化為螺甾皂苷。酵母菌產生相關生物酶，使原薯蕷皂苷在發酵過程中自薯蕷藥材細胞中破壁而出，同時使薯蕷皂苷更好地擴散于提取介質中，其中的水解酶使原薯蕷皂苷C-26位上糖鏈斷裂獲得薯蕷皂苷，因此薯蕷皂苷含量有了顯著的提升。

圖8 原薯蕷皂苷的微生物轉化途徑

2.1.2 細菌發酵 1株弗吉尼亞鏈霉菌IBL14被報道將薯蕷皂苷元發酵轉化為異壬酮，中間產物為薯蕷酮，研究人員揭示其轉化機制是由菌株發酵產生的膽固醇氧化酶將苷元催化生成薯蕷酮，薯蕷酮C-25位發生羥基化得到異壬酮，這是首次發現薯蕷皂苷元C-25位上的叔羥基化反應[64]。轉化途徑見圖9。

薯蕷皂苷出現了皂苷與皂苷元之間的轉化，同樣以糖苷酶水解脫糖為主，進一步暴露苷元結構。在這些微生物發酵過程中，產生了罕見的細胞色素P450單加氧酶，催化特定位點發生羥基化。而另一種特殊的膽固醇氧化酶導致羰基化，催化生成新的化合物。

圖9 弗吉尼亞鏈霉菌發酵轉化薯蕷皂苷元的途徑

2.2 知母皂苷

知母皂苷主要來源于百合科植物知母Bunge，屬于甾體皂苷類，包括知母皂苷I～IV、AI～AIV、BI～BIV等[65]，知母皂苷具有抗腫瘤、抗抑郁、抗阿爾茨海默病、降血壓、降血糖等藥理活性[66]，對于某些知母皂苷，改變構型或進行結構修飾可以增強其原有的藥效或減輕不良反應。

Hu等[67]利用釀酒酵母發酵轉化知母皂苷AIII，最終目標產物為其立體異構體(20,25)-5β-spirostane- 3β-ol-3--β-glucopyranosyl-β-galacopyanoside（10-1），知母皂苷AIII及其立體異構體均具有生長抑制作用，轉化途徑見圖10。此轉化過程中，知母皂苷AIII首先在糖基轉移酶催化下C-26位開環并發生糖基化反應生成知母皂苷BII；其次知母皂苷BII脫水生成知母皂苷BIII；知母皂苷BIII通過加水、環化、重排3個反應生成知母皂苷AIII的立體異構體；知母皂苷BII及知母皂苷BIII的C-15位羥基化分別生成15-羥基-知母皂苷BII和15-羥基-知母皂苷BIII。發酵工藝優化有望更高效地生產化合物10-1。

Zhao等[68]利用膠孢炭疽菌轉化知母皂苷BII，轉化途徑見圖11，通過鑒別其代謝物結構來推斷藥理作用機制。研究證明，此菌中的糖苷酶可以同時水解C-3位和C-26位葡萄糖得到知母皂苷AI和知母皂苷AIII，并產生了水解產物的C-22位對映異構體[(25)-5β-spirostan-3β-yl]2--(β-glucopyranosyl)-β-galactopyranoside（11-1）和25()-22β--spirostane-3β--galactopyranside（11-2），最終異構體的轉化量多于原型，這是關于單一微生物同時裂解C-3位和C-26位糖基的首次報道。

甾體皂苷的微生物轉化中，多數以皂苷與皂苷元之間的相互轉化為主，其中在C-3、C-26位通常會發生水解反應，羥基化主要發生在C-7、C-11、C-12、C-15、C-21、C-25位等，C-20位發生還原反應，C-26位易開環發生糖基化反應。與三萜皂苷相比，甾體皂苷的微生物轉化機制簡單，涉及到的反應類型少，但為特定衍生物的大規模生產提供了新方法。

3 結語與展望

通過微生物發酵技術，可以將皂苷類化合物轉化為多種衍生物，為生物活性篩選提供新的結構，同時也是特殊皂苷類化合物擴大生產的有效途徑。能夠進行皂苷類成分生物轉化的微生物種類繁多，包括細菌和真菌，轉化機制主要有羥基化、糖基化、羰基化、水解和酯化等；與真菌相比，細菌的相關報道較少，且轉化機制與真菌類似，而其他類型的微生物如放線菌的發酵和轉化則更為少見。目前，微生物發酵轉化皂苷類化合物取得了較大的進展，但在技術和方法上仍需著力解決以下幾個方面的問題。首先，菌種的選育是微生物發酵的前提，大多數研究所選用的菌種包括3個來源：一是從能夠產生糖苷酶的已知菌種中篩選出轉化效率高的優良菌種；二是從藥用植物生長環境中的微生物篩選出具有轉化優勢的優良菌種；三是從植株機體組織所含有的內生菌中篩選優良菌種，內生菌作為植株中不可或缺的一部分，與植株同生長、共進化，在轉化藥用植物的有效成分上具有不可比擬的優勢。其次，皂苷與微生物發酵體系的穩定性是轉化過程的重要方面，擁有穩定的轉化體系，可以擴大培養規模，提高轉化率，節約生產成本，因此開發固定化的發酵體系是解決問題的關鍵。此外，在優良的發酵菌種和穩定的發酵體系基礎上，產物的分離技術仍有待提高，根據特定的產物結構開發應用合理且降低生產成本的分離手段，將會推進微生物發酵轉化皂苷類化合物持續走向工業化進程。

圖10 知母皂苷AIII的微生物轉化途徑

圖11 知母皂苷BII微生物轉化途徑

微生物發酵轉化皂苷類化合物的機制還有很大的研究空間，應用現代色譜、質譜等技術，深度挖掘皂苷類成分的轉化原理，隨著酶工程、蛋白組學、代謝組學、基因工程等技術的迅速發展，可以通過多基因集成的工程菌，實現皂苷類化合物多步驟的系列轉化，為藥物的基礎性研究和新藥研發提供新思路、新途徑。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on mechanism of transformation of saponins by microbial fermentation

LI Qian, YU Dan, GUO Li-dong, DU Xiao-wei

College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

Saponins are a class of important chemical components in natural medicines. Microbial fermentation technology can convert saponins into various derivatives. The microorganisms that can transform saponins are mainly bacteria and fungi. The hydrolysis reaction is the main method, and the sugar group is removed, which can improve the bioavailability and pharmacological activity of the transformation product. In addition, through reactions such as hydroxylation, glycosylation, carbonylation, and esterification, the side effects of the substrate are reduced, and the drug efficacy is improved. The microbial transformation of steroidal saponins is mainly based on the mutual transformation between saponins and sapogenins, which is an effective way to realize the large-scale production of some special saponins. In this paper, ginsenoside, glycyrrhetinic acid, astragaloside, dioscin, timosaponin and other medicinal materials are used as examples to analyze the microbial transformation mechanism of saponins, in order to provide reference for the biosynthesis of saponins and the development of new drugs.

microbial fermentation; triterpenoid saponins; steroidal saponins; ginsenoside; glycyrrhetinic acid; astragaloside; dioscin; timosaponin; biotransformation; mechanism

R282.15

A

0253 - 2670(2022)22 - 7264 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.031

2022-06-21

國家自然科學基金資助項目（81872967）

李 倩（1999—），女，碩士研究生。E-mail: LQ18847101179@163.com

都曉偉（1962—），女，教授，博士，研究方向為中藥質量標準與新藥研發。Tel: (0451)87260824 E-mail: xiaoweidu@hotmail.com

[責任編輯 崔艷麗]