人參固本口服液對椎間盤退變小鼠腸道菌群的影響

李藝璇，姜艷玲，廖 鎰，王 偉，歐儒珍，唐樹杰*，孫國棟*

人參固本口服液對椎間盤退變小鼠腸道菌群的影響

李藝璇1，姜艷玲2#，廖 鎰1，王 偉2，歐儒珍3，唐樹杰1*，孫國棟3*

1. 暨南大學中醫學院，廣東 廣州 510630 2. 魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006 3. 暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630

研究人參固本口服液對椎間盤退變小鼠腸道菌群的影響。28只小鼠隨機分為假手術組、模型組、布洛芬（90 mg/kg）組和人參固本口服液（3 mL/kg），每組7只。采用尾部全層穿刺法制備椎間盤退變模型，給予相應藥物干預28 d，拍攝尾部核磁共振；采用蘇木素-伊紅（HE）、番紅固綠染色觀察小鼠肝、腎、椎間盤的病理變化；采用16S rRNA高通量測序檢測小鼠結腸內腸道菌群組成和結構。與假手術組比較，模型組椎間盤結構明顯破壞；腸道菌群α多樣性分析Chao指數、Shannon指數無明顯差異，β多樣性PC1、PC2水平均有明顯偏移；疣微菌門（Verrucomicrobiota）、巴氏桿菌門（Patescibacteria）、杜氏桿菌屬、阿克曼氏菌屬的相對豐度顯著降低（＜0.05、0.01），糞桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，人參固本口服液組失序的椎間盤結構得到修復；腸道菌群α多樣性Chao指數、Shannon指數顯著升高（＜0.05），β多樣性在PC1水平更趨向于假手術組；疣微菌門、Lachnospiraceae_NK4A136_group、阿克曼氏菌屬、回腸桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），糞桿菌屬相對豐度顯著降低（＜0.001）。人參固本口服液能夠修復髓核、纖維環的結構，減輕炎性細胞浸潤，延緩椎間盤退變的病理過程，其機制可能與調控腸道菌群微環境有關。

人參固本口服液；椎間盤退變；腸道菌群；髓核；纖維環

全球約5.4億人受到腰背痛的困擾[1]，承受著巨大的身體負擔和經濟壓力[2]。椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）導致椎間盤機械穩定性以及力的傳導功能下降，與腰背痛有著密不可分的聯系[3]。目前的治療方式主要包括非甾體類抗炎藥、康復鍛煉、心理輔導、介入及手術治療等[4]，但是均無法恢復甚至逆轉IVDD的病理改變。此外，長期服用非甾體類抗炎藥具有消化道出血及肝腎損傷的風險。為緩解病人痛苦、提高患者的生活質量，尋找有效和不良反應小的治療藥物十分必要。

傳統醫學在治療腰痛方面具有很好的療效。傳統醫學認為，腰為腎之府，故IVDD的治療應從腎論治。人參固本口服液[5]是在六味地黃丸的基礎上，添加人參、天冬及麥冬，具有固本培元、補腎填精的功效。研究發現，骨相關疾病與腸道菌群失調有密切關系[6-7]。考慮到腸道菌群在關節穩態中起重要作用[8]，因此本研究從腸道菌群角度探究人參固本口服液治療IVDD的作用及其機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，4～6周齡，體質量20～25 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SYXK（粵）2017-0174。動物飼養于暨南大學動物實驗中心，室溫20～24 ℃，相對濕度52%～64%，光照周期10～14 h，自由進食飲水，實驗前適應性飼養10 d。動物實驗經暨南大學動物實驗中心倫理委員會批準（批準號IACUC-20220221-07）。

1.2 藥品與試劑

人參固本口服液（批號29190332，10 mL/支）購自魯南厚普制藥有限公司；布洛芬緩釋膠囊（批號H20066822，0.3 mg/粒）購自珠海潤都制藥股份有限公司；DNA抽提試劑盒購自MP Biomedicals公司；瓊脂糖購自Biowest公司；Fast Pfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；建庫試劑盒購自Bioo Scientific公司；測序試劑盒購自美國Illumina公司；4%多聚甲醛（批號043368）購自ALFA公司；1.25%三溴乙醇（批號T48402）購自美國Sigma公司；無水乙醇（批號10009218）購自上海國藥集團化學試劑有限公司；二甲苯（批號X820585）購自廣州叢源儀器有限公司；中性樹膠（批號yk-3313）購自廣州市佳研生物有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號GP1031）、番紅固綠染液套裝（批號G1031）、環保型脫蠟透明液（批號G1128）、分化液（批號G1039）購自Servicebio公司。

1.3 儀器

DYY-6C型核酸電泳儀、ND2000型光度計、94/30型小動物磁共振成像系統（BioSpec公司）；Donatello脫水機、Giotto染色機（Diapath公司）；JB-P5型包埋機、JB-L5型凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；Eclipse E100型正置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；9700型PCR儀（美國ABI公司）；Quantus?高靈敏熒光計（Promega公司）；Miseq PE300型測序平臺（上海美吉生物公司）。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

28只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組、模型組、布洛芬（90 mg/kg）組和人參固本口服液（3 mL/kg，相當于臨床等效劑量）組，每組7只。除假手術組外，其余各組均采用尾部全層穿刺法制備IVDD模型[9]：小鼠ip 1.25%三溴乙醇麻醉（0.3 mL/只），沿矢狀面切開尾部Co3～5節段皮膚，暴露Co3～4、Co4～5椎間盤，31G注射器針頭沿平行軟骨終板的方向刺入1.5 mm，進入纖維環、髓核后，軸向旋轉180°，保持10 s，縫合，青霉素鈉涂抹傷口防止感染。假手術組僅切開尾部皮膚，不予椎間盤穿刺。各給藥組ig相應藥物，假手術組和模型組ig生理鹽水（3 mL/kg），1次/d，連續28 d。

2.2 椎間盤核磁共振成像檢測

末次給藥后禁食12 h，使用小動物呼吸麻醉機用異氟烷麻醉小鼠，對小鼠Co3～5椎間盤進行核磁共振成像檢測。

2.3 肝、腎、椎間盤的HE與番紅固綠染色觀察

小鼠于無菌環境中脫頸椎處死，取肝、腎、椎間盤，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，肝、腎組織切片進行常規HE染色，椎間盤組織切片脫鈣后進行HE和番紅固綠染色，于顯微鏡下觀察肝、腎、椎間盤組織病理變化。

2.4 16S rRNA測序分析

2.4.1 DNA抽提及PCR擴增 取各組小鼠結腸組織，收集結腸內糞便樣本至無菌Ep管中，于?80 ℃保存。參照DNA提取試劑盒說明書抽提基因組DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增16S rDNA的V3～4可變區。引物序列：338F為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，806R為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

2.4.2 Illumina Miseq測序分析 用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，用DNA凝膠回收試劑盒純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，用高靈敏熒光計檢測定量，在Illumina MiSeq平臺將純化后的擴增片段構建文庫與測序。

2.5 統計學分析

3 結果

3.1 椎間盤核磁共振成像檢測

如圖1所示，假手術組小鼠椎間盤形態完整，T2W1呈均勻高信號；終板形態完整，與椎間盤有明顯的分界，T2W1呈均勻低信號。模型組小鼠椎間盤形態被破壞，T2W1呈低信號；終板表面毛糙，T2W1呈點狀高信號。布洛芬組小鼠椎間盤形態差，T2W1呈低信號；終板破裂，T2W1點狀高信號融合成片。人參固本口服液組小鼠椎間盤形態欠佳，T2W1部分高信號；終板表面欠平整，與椎間盤分界尚可，T2W1呈點狀高信號。

3.2 組織學病理觀察

3.2.1 肝、腎組織HE染色觀察 如圖2所示，各組小鼠肝組織結構清楚，肝細胞排列致密有序，細胞膜及核膜完整，胞質均勻，中央靜脈形態正常。各組小鼠腎組織結構清晰完整，皮髓分界清晰，腎小球、腎小管形態正常。

3.2.2 椎間盤HE與番紅固綠染色觀察 如圖3所示，假手術組小鼠髓核結構形態完整，細胞排列正常，纖維環有序層狀排列，未見炎性細胞浸潤。模型組小鼠髓核結構丟失，細胞明顯減少，分布散亂，空泡樣明顯，部分區域被纖維環組織填充侵占，纖維環失去有序層狀排列，伴有明顯的炎性細胞浸潤。布洛芬組損壞的髓核結構有所修復，細胞排列欠佳，纖維環排列欠有序，可見炎性細胞浸潤。人參固本口服液組小鼠損壞的髓核結構尚可，髓核細胞趨于整齊，纖維環結構相對完整，可見少量的炎性細胞浸潤。

3.3 腸道微生物測序質量評價

各組小鼠各隨機抽取4個結腸內糞便樣本，進行16S rRNA測序，優化后序列數目為4 013 568，堿基數目為1 699 712 622，平均長度為423 bp。經過聚類分析，得到12個門、18個綱、46個目、77個科、148個屬、225個種和610個OTU。

圖1 各組小鼠椎間盤的核磁共振成像檢測

圖2 各組小鼠肝、腎組織HE染色

圖3 各組小鼠椎間盤的HE (A) 與番紅固綠(B) 染色

Shannon指數稀釋曲線直接或間接反映測序數據量的合理性及物種的豐富程度，等級聚類曲線的曲線寬度和平緩度分別代表了物種豐富度及均勻度。如圖4-A、B所示，稀釋曲線達到平臺期，等級聚類曲線趨于平緩，表明數據量漸進合理，物種分布較均勻，豐富度較高。與假手術組比較，模型組豐富度、均勻度無明顯變化；與模型組比較，各給藥組豐富度、均勻度上升，其中人參固本口服液組有明顯差異。Venn圖可反映各組之間共有和獨有的OTU數目及樣本群落組成的相似度。如圖4-C所示，4組樣本有127個重疊OTU，假手術組、模型組、布洛芬組和人參固本口服液組分別獨有22、23、24、78個OTU。

A-稀釋曲線 B-等級聚類曲線 C-各組OTU數量的Venn圖

3.4 α多樣性分析

α多樣性是指通過對單個樣品的多樣性分析，來評估腸道群落物種的豐度及多樣性，其中Chao指數、Shannon指數分別表示物種豐度、多樣性。如圖5-A、B所示，與假手術組比較，模型組Chao指數和Shannon指數無明顯差異；與模型組比較，人參固本口服液組Chao指數和Shannon指數均顯著升高（＜0.05）。如圖5-C所示，在種水平上，與模型組比較，各給藥組_valens的相對豐度明顯升高，uncultured__g_的相對豐度明顯降低。

3.5 β多樣性分析

β多樣性用于進一步評估組別間的微生物組成。主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、非度量多維尺度法（non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）是研究Beta多樣性的可視化方法，樣本間的距離與菌群組成結構的相似值呈負相關，即樣本點越接近，其物種組成越相似。如圖6所示，與假手術組比較，模型組在PC1、PC2水平均有明顯偏移，表明模型組小鼠腸道菌群結構與組成明顯改變；與模型組比較，各給藥組在PC1水平更趨向于假手術組，提示給藥后腸道菌群的整體結構發生了實質性的變化。NMDS分析結果與PCoA分析趨勢一致。

3.6 菌群結構組成分析

如圖7-A所示，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidota）為優勢菌種，與假手術組比較，模型組放線菌門（Actinobacteriota）和疣微菌門（Verrucomicrobiota）的相對豐度明顯降低；與模型組比較，人參固本口服液組菌群組成及豐度明顯逆轉。如圖7-B所示，在屬水平上，假手術組優勢菌種為杜氏桿菌屬，模型組的優勢菌種為糞桿菌屬。與模型組比較，各給藥組回腸桿菌屬相對豐度明顯升高，糞桿菌屬相對豐度明顯降低。

A-Chao指數 B-Shannon指數 C-種水平各組腸道菌群組成分布 與模型組比較：*P＜0.05

A-PCoA分析 B-NMDS分析

圖7 門水平(A) 和屬水平 (B) 各組腸道菌群結構組成

組間差異顯著性檢驗是利用樣本檢驗得到的群落豐度數據，通過統計學方法對不同群落微生物豐度差異種進行假設檢驗，評價樣本間差異的顯著性。如圖8所示，門水平上，與假手術組比較，模型組菌群中的疣微菌門和巴氏桿菌門（Patescibacteria）相對豐度顯著降低（＜0.05、0.01）；與模型組比較，人參固本口服液組疣微菌門相對豐度顯著升高（＜0.05）。在屬水平上，與假手術組比較，模型組糞桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.001），為優勢物種，杜氏桿菌屬和阿克曼氏菌屬相對豐度顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，布洛芬組回腸桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.001），人參固本口服液組Lachnospiraceae_NK4A136_group、阿克曼氏菌屬和回腸桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.05、0.001），糞桿菌屬相對豐度顯著降低（＜0.001）。

4 討論

椎間盤是軟骨結構，包含與上下椎體連接的終板、纖維環及髓核。正常情況下，纖維環、髓核承擔不同軸向的壓力載荷，維持脊柱多方向的運動。而椎間盤內組織細胞和生物化學改變，導致結構失衡，該過程即IVDD。目前臨床常用補益肝腎的藥物治療腰痛。人參固本口服液由人參、麥冬、天冬加六味地黃丸組成，方中人參、熟地、山茱萸、山藥為君，填精益髓、補氣養血；茯苓健脾益氣；麥冬、天冬養陰益氣；澤瀉、牡丹皮補瀉相宜，瀉腎濁。椎間盤核磁共振成像及病理結果表明，人參固本口服液能夠修復髓核、纖維環的結構，減輕炎性細胞浸潤，從而延緩IVDD的病理過程。表明人參固本口服液能夠有效改善IVDD。

Sham-對照組 IVDD-模型組 IB-布洛芬組 RSGB-人參固本口服液組 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

胃腸道微生物是人體內最豐富的微生物群，通常處于動態平衡狀態。研究發現，腸道菌群在關節穩態中發揮重要作用。隨著年齡增長，膝骨關節炎發病率的升高與腸道通透性的增加呈正相關[8,10]。腸道菌群通過調節自身代謝產物，調節免疫應答系統，從而影響骨代謝如骨質疏松、股骨頭壞死等[11-12]。本研究基于16S rRNA技術發現模型組與假手術組小鼠腸道菌群Alpha多樣性無明顯差異，而Beta多樣性存在差異，疣微菌門、巴氏桿菌門、杜氏桿菌屬、阿克曼氏菌屬的相對豐度降低，糞桿菌屬相對豐度升高。與模型組比較，人參固本口服液組腸道菌群的豐度和均勻度增加，疣微菌門、阿克曼氏菌屬、Lachnospiraceae_NK4A136_group和回腸桿菌屬相對豐度升高，糞桿菌屬相對豐度下降。

研究表明，杜氏桿菌屬減少后，能夠激活:核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，從而引起腸道及神經炎癥[13]，提示IVDD后，小鼠腸道內與炎癥相關腸道微生物群增加，腸道菌群穩態遭到破壞。疣微菌門及該門中的阿克曼氏菌屬在增強免疫力、抗腫瘤、抗衰老、維持腸道穩態和抗炎方面有重要作用[14]。IVDD小鼠給予人參固本口服液后，腸道內疣微菌門、阿克曼氏菌屬為優勢物種，其相對豐度顯著升高。表明人參固本口服液可以調控IVDD小鼠腸道菌群微生態，改善菌群多樣性及豐度，影響菌群代謝。

綜上，人參固本口服液能夠通過調控腸道菌群微環境，有效延緩IVDD。人參固本口服液補腎機制可能是通過調節腸道微生態實現的，符合“養后天以滋先天”的中醫理論。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Ginseng Guben Oral Liquid on intestinal flora in mice with intervertebral disc degeneration

LI Yi-xuan1, JIANG Yan-ling2, LIAO Yi1, WANG Wei2, OU Ru-zhen3, TANG Shu-jie1, SUN Guo-dong3

1. School of Traditional Chinese Medicine, Jinan University, Guangzhou 510630, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 3. The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China

To study the effect of Ginseng Guben Oral Liquid (人參固本口服液) on intestinal flora of mice with intervertebral disc degeneration (IVDD).Twenty-eight mice were randomly divided into sham operation group, model group, ibuprofen (90 mg/kg) group and Ginseng Guben Oral Liquid (3 mL/kg), with seven mice in each group. The model of IVDD was made by tail full-thickness puncture, and corresponding drugs were given for 28 d, tail nuclear magnetic resonance was taken; HE and saffron fast green staining were used to observe the pathological changes of liver, kidney and intervertebral disc in mice; 16S rRNA high-throughput sequencing was used to detect the composition and structure of intestinal flora in colon of mice.Compared with sham operation group, intervertebral disc structure in model group was obviously destroyed; There was no significant difference in Chao index and Shannon index of α diversity analysis in intestinal flora, but PC1 and PC2 levels of β diversity were obviously deviated; Relative abundance of Verrucomicrobiota, Patescibacteria,andwere significantly decreased (< 0.05, 0.01), whilerelative abundance was significantly increased (< 0.001). Compared with model group, disordered intervertebral disc structure in Ginseng Guben Oral Liquid group was repaired; Chao index and Shannon index of α diversity analysis in intestinal flora were significantly increased (< 0.05), β diversity tended to sham-operation group at PC1 level; Relative abundance of Verrucomicrobiota, Lachnospiraceae_NK4A136_group,andwere significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), while relative abundance ofwas significantly decreased (< 0.001).Ginseng Guben Oral Liquid can repair the structure of nucleus pulposus and annulus fibrosus, reduce the infiltration of inflammatory cells and delay the pathological process of IVDD, and its mechanism may be related to the regulation of intestinal flora microenvironment.

Ginseng Guben Oral Liquid; intervertebral disc degeneration; intestinal flora; nucleus pulposus; annulus fibrosus

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7121 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.015

2022-07-28

中藥制藥共性技術國家重點實驗室開放基金資助項目（202009）

李藝璇（1996—），女，碩士，研究方向為脊柱骨關節病。Tel: 15521321703 E-mail: liyixuanhenan@163.com

唐樹杰，男，博士，研究方向為脊柱骨關節病。Tel: (020)85226289 E-mail: tsj697@163.com

孫國棟，男，博士，研究方向為脊柱骨科。Tel: 15521382902 E-mail: sgd96@jnu.edu.cn

#共同第一作者：姜艷玲（1990—），女，碩士，研究方向為中藥及天然藥物有效成分及質量控制。Tel: 15098860396 E-mail: m15098860396@163.com

[責任編輯 李亞楠]