黃芪屬植物DNA條形碼與聚類分析的研究

常晶茹，姚萱航，張雪薇，周 儀，劉翠晶，劉 霞

黃芪屬植物DNA條形碼與聚類分析的研究

常晶茹，姚萱航，張雪薇，周 儀，劉翠晶，劉 霞*

吉林農業大學中藥材學院，省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室，吉林 長春 130118

通過分析吉林產10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL、psbA條形碼序列，為黃芪屬植物的物種分類鑒定及其親緣關系提供理論依據。共收集30份樣品，以ITS2、matk、rbcL和psbA作為條形碼序列，對黃芪屬10種植物提取基因組DNA、PCR擴增并進行雙向測序。所得序列結果經校正處理后，并對其進行聚類分析。ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段，單獨的每一種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，即蒙古黃芪var.、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪；由聚類分析結果可知，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨1支，細葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為1支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關系較近。ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來。聚類分析結果顯示10種黃芪屬植物被劃分為5支，該聚類分析結果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的傳統分類相一致。

黃芪屬；DNA條形碼；聚類分析；親緣關系；膜莢黃芪；蒙古黃芪；扁莖黃芪；斜莖黃芪；糙葉黃芪；華黃芪；草木樨黃芪；細葉黃芪；興安黃芪；新巴黃芪

黃芪屬L.是豆科植物中的一個大屬，約2000種，我國黃芪屬共有8個亞屬，278種，2亞種，35變種和2變型。吉林省黃芪屬植物共有10種，約占世界種類的0.4%，約占中國種類的3.1%。關于黃芪屬的分類問題一直存在爭議，亞屬及種的分歧也較大[1]。關于物種的分類與鑒定、中藥材正品與偽品的鑒別有許多傳統的經典方法，如形態學、解剖學、細胞學、化學分類學、數量分類學等[2-9]。每種方法各有一定的優勢，但也存在著一定的局限性，中藥黃芪資源比較豐富，各地栽培種源混雜[10]，藥材市場還充斥著許多假冒偽劣品[11-13]，致使其藥材產量與質量不穩，不能確保黃芪臨床應用的可靠性與有效性，因此對黃芪資源進行準確的物種鑒定與真偽品的鑒別具有重要意義。近年來，DNA條形碼技術應運而生，正好為解決這一難題提供了一種更好的鑒定方法。DNA條形碼是指生物體內能夠代表該種的、標準的、有足夠變異的、易擴增且相對較短的片段[14-16]。DNA條形碼技術是利用生物體DNA中一段保守片段對物種進行快速準確鑒定的新技術[17-19]。對于種子植物的研究，中國科學院研究團隊建議將ITS作為種子植物核心DNA條形碼，同時也有學者建議將psbA-trnH作為輔助序列[20-23]。本研究對分布于吉林省的10種黃芪屬植物的DNA條形碼進行了聚類分析，探索了10種黃芪屬植物的親緣關系，本研究對于黃芪屬植物的物種分類鑒定及親緣關系的研究具有重要意義。

1 材料

本研究采用吉林產10種黃芪屬植物為材料，由吉林農業大學劉霞副教授進行了物種的鑒定分別為膜莢黃芪(Fisch.) Bunge、蒙古黃芪(Fisch.) Bunge var.(Bunge) Hsiao、扁莖黃芪Bunge、斜莖黃芪Jacquin、糙葉黃芪Bunge、華黃芪L. F.、草木樨黃芪Pall.、細葉黃芪Bunge興安黃芪(Pall.) DC.、新巴黃芪P. Y. Fu et Y. A. Chen，其中細葉黃芪、糙葉黃芪、斜莖黃芪、華黃芪、興安黃芪、扁莖黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪于2019年9月采自吉林省乾安縣，蒙古黃芪、膜莢黃芪于2019年9月采自吉林農業大學藥用植物園。錦雞兒信息出自GenBank數據庫。

2 方法

2.1 ITS2、matk、rbcL和psbA條形碼片段的比較研究

2.1.1 DNA的提取與檢測 使用冷凍保存的葉片，依據新型植物基因組DNA快速提取試劑盒操作進行提取。對DNA純度應用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，濃度以紫外分光光度法進行測定，每種選取3株進行重復。

2.1.2 PCR擴增 選擇對應的擴增引物對樣品DNA進行PCR擴增，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

PCR擴增在PCR擴增儀內完成，其反應體系為2×Taq PCR MasterMix 9 μL，正反方向引物各0.6 μL（10 μmol/L），DNA模板1 μL，去離子水補足至20 μL；反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；循環后72 ℃延伸10 min。

2.1.3 PCR產物回收及序列測定 使用1%瓊脂糖對PCR擴增產物非目的片段進行電泳檢測，將目的片段通過多功能DNA純化回收試劑盒純化后再進行測序處理。測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

2.2 聚類分析

測序結果經chromas軟件進行結果校正，在GenBank核苷酸數據庫中Blast檢索，將候選序列進行比對處理，經過Clustal軟件自動處理后，再經GenDoc軟件人工校正，采用Mega 5.1軟件對10種黃芪屬植物進行聚類分析。

3 結果與分析

3.1 ITS2、matk、rcbL和psbA條形碼片段比較分析

10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL、psbA序列片段測定結果分別見圖1～4。由圖1可知，細葉黃芪、糙葉黃芪、新巴黃芪和草木樨黃芪的ITS2序列長為227 bp，而其余黃芪屬植物的ITS2序列長為230 bp；10種黃芪屬植物ITS2序列中GC含量為51%～52%。其中細葉黃芪、糙葉黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪4種植物的ITS2序列一致；華黃芪、斜莖黃芪、膜莢黃芪3種植物的ITS2序列一致；而興安黃芪有5個位點的堿基發生變化，分別為78、91、108、221、228位點；蒙古黃芪有6個位點的堿基發生變化，分別為118、130、195、204、207、232位點；扁莖黃芪有9個位點的堿基發生變化，分別為73、75、94、101、124、134、145、163、166位點。由圖2可知，10種黃芪屬植物的matk序列長均為234 bp，其matk序列的GC含量為32%～33%。其中蒙古黃芪在121、219位點的堿基發生變化；華黃芪、斜莖黃芪和膜莢黃芪3種植物的matk序列一致；扁莖黃芪、糙葉黃芪、草木樨黃芪、細葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪的matk序列均一致。

圖1 10種黃芪屬植物ITS2序列矩陣

圖2 10種黃芪屬植物matk序列矩陣

圖3 10種黃芪屬植物rbcL序列矩陣

圖4 10種黃芪屬植物psbA序列矩陣

由圖3可知，10種黃芪屬植物的rbcL序列長為240 bp，其rbcL序列的GC含量為45%～46%。其中細葉黃芪、新巴黃芪和草木樨黃芪3種植物的rbcL序列一致；華黃芪、斜莖黃芪和膜莢黃芪3種植物的rbcL序列一致；糙葉黃芪和扁莖黃芪的rbcL序列一致。而興安黃芪在108位點發生了堿基變化；蒙古黃芪在21位點發生了堿基變化。

由圖4可知，10種黃芪屬植物的psbA序列長為157 bp，其psbA序列的GC含量為48%～49%。其中斜莖黃芪與膜莢黃芪的psbA序列一致；扁莖黃芪、蒙古黃芪、新巴黃芪、草木樨黃芪的psbA序列一致；而糙葉黃芪在101位點的堿基發生了變化；華黃芪在68、124位點的堿基發生了變化；興安黃芪在133、134位點的堿基發生了變化；細葉黃芪在68位點的堿基發生變化。

由上可知，在10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段中，單獨的每種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，ITS2序列可將興安黃芪、蒙古黃芪、扁莖黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別；matk序列可將蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別；rbcL序列可將興安黃芪、蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別；psbA序列可將糙葉黃芪、華黃芪、興安黃芪、細葉黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別，而ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來，即蒙古黃芪、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪。

3.2 聚類分析

10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼序列的聚類分析結果見圖5。本研究獲得了40條黃芪屬植物的條形碼片段，在GenBank數據庫中檢索到19條黃芪屬植物的條形碼片段（表2）。10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼的聚類分析結果表明，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨1支，細葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為一支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關系較近，該聚類分析結果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的傳統分類相一致。據《中國植物志》記載，糙葉黃芪、斜莖黃芪、新巴黃芪屬于裂萼亞屬；蒙古黃芪、膜莢黃芪、草木樨黃芪屬于黃芪亞屬；細葉黃芪、扁莖黃芪屬于簇毛亞屬；興安黃芪屬于一年生亞屬；華黃芪屬于華黃芪亞屬。本研究的聚類分析結果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類結果完全一致。

4 討論

對分布于吉林省的10種黃芪屬植物的ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段進行了比較分析，并在此基礎上對10種植物進行了聚類分析，探討了10種植物的親緣關系。結果顯示在ITS2、matk、rbcL和psbA 4種片段中，單獨的每一種片段并不能將10種植物全部鑒別出來，只能鑒別出部分植物，ITS2序列可將興安黃芪、蒙古黃芪、扁莖黃芪與其他黃芪屬植物進行鑒別；matk序列可將蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別；rbcL序列可將興安黃芪、蒙古黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別；psbA序列可將糙葉黃芪、華黃芪、興安黃芪、細葉黃芪與其余黃芪屬植物進行鑒別，而ITS2＋rbcL＋psbA組合可以將8種黃芪屬植物鑒別出來，即蒙古黃芪、扁莖黃芪、糙葉黃芪、華黃芪、草木樨黃芪、細葉黃芪興安黃芪、新巴黃芪；10種黃芪屬植物基于4種DNA條形碼序列的聚類分析結果可知，以錦雞兒為外類群，10種植物中，華黃芪為單獨1支，細葉黃芪與扁莖黃芪聚為1支，糙葉黃芪、斜莖黃芪與新巴黃芪聚為1支，膜莢黃芪、蒙古黃芪與草木樨黃芪聚為1支，并且這3者與興安黃芪關系較近，此聚類方式與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類相吻合。據《中國植物志》記載，糙葉黃芪、斜莖黃芪、新巴黃芪屬于裂萼亞屬；蒙古黃芪、膜莢黃芪、草木樨黃芪屬于黃芪亞屬；細葉黃芪、扁莖黃芪屬于簇毛亞屬；興安黃芪屬于一年生亞屬；華黃芪屬于華黃芪亞屬。本研究的聚類分析結果與《中國植物志》中10種黃芪屬植物的分類方式完全一致。

圖5 10種黃芪屬植物的聚類分析與傳統分類

表2 GenBank數據庫中黃芪屬植物及錦雞兒ITS2、matk、rbcL、psbA序列信息

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 周太炎等編著. 中國植物志(第42(1)卷) [M]. 北京: 科學出版社, 1993: 78-82.

[2] 燕玲, 宛濤, 張眾, 等. 膜莢黃芪與蒙古黃芪植物學特征分析 [J]. 內蒙古農業大學學報: 自然科學版, 2001, 22(4): 71-77.

[3] 張明理, 席以珍, 康云, 等. 國產黃耆屬簇毛黃耆亞屬花粉形態及其系統學意義 [J]. 云南植物研究, 2003, 25(1): 46-54.

[4] 黎斌, 常朝陽, 李思鋒, 等. 中國西北地區11種黃耆屬植物的細胞學研究[J]. 西北植物學報, 2002, 22(3): 467-475.

[5] 張慶芝, 吳曉俊, 劉滌, 等. 黃芪及其民間習用品DNA指紋圖譜和有效成分含量的比較 [J]. 中國藥學雜志, 2005, 40(6): 457-459.

[6] Liston A. Variation in the chloroplast genes rpoC1 and rpoC2 of the genus(Fabaceae): Evidence from restriction site mapping of a PCR-amplified fragment [J]., 1992, 79: 953-961.

[7] 丁士友, 顧紅雅, 瞿禮嘉, 等. PCR產物的RFLP分析在黃芪亞族(豆科)系統學研究中的應用初探 [J]. 植物學報, 1995, 37(2): 97-102.

[8] Cheng K T, Tsay H S, Chen C F,. Determination of the components in a Chinese prescription, Yu-Ping-Feng San, by RAPD analysis [J]., 1998, 64(6): 563-565.

[9] Na H J, Um J Y, Kim S C,. Molecular discrimination of medicinalby RAPD analysis [J]., 2004, 26(2): 265-272.

[10] 趙明, 段金廒, 黃文哲, 等. 中國黃芪屬(Linn.)藥用植物資源現狀及分析 [J]. 中國野生植物資源, 2000, 19(6): 5-9.

[11] 婁千, 辛天怡, 宋經元. DNA條形碼技術在中藥全產業鏈的應用進展 [J]. 藥學學報, 2020, 55(8): 1784-1791.

[12] 蔡金龍, 謝世清, 張廣輝, 等. 藥用植物DNA條形碼鑒定研究進展 [J]. 植物科學學報, 2017, 35(3): 452-464.

[13] Chen S L, Pang X H, Song J Y,. A renaissance in herbal medicine identification: From morphology to DNA [J]., 2014, 32(7): 1237-1244.

[14] 陳士林, 姚輝, 韓建萍, 等. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(2): 141-148.

[15] Prasad P K, Tandon V, Biswal D K,. Phylogenetic reconstruction using secondary structures and sequence motifs of ITS2 rDNA of(Kerbert, 1878) Braun, 1899 (: Paragonimidae) and related species [J]., 2009, 10(Suppl 3): S25.

[16] Chen S L, Pang X H, Song J Y,. A renaissance in herbal medicine identification: From morphology to DNA [J]., 2014, 32(7): 1237-1244.

[17] 鄭輝, 鄧楷煜, 陳安琪, 等. 基于DNA條形碼的川貝母及其近緣種的分子鑒定與親緣關系研究 [J]. 藥學學報, 2019, 54(12): 2326-2334.

[18] 蔡一鳴, 代江鵬, 鄭雨欣, 等. 鉤藤屬植物分子鑒定的DNA條形碼篩選[J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1828-1837.

[19] Zhang J M, Wang J X, Xia T,. DNA barcoding: Species delimitation in tree peonies [J]., 2009, 52(6): 568-578.

[20] 韋雅露, 張雁春, 李秋娥, 等. 含巖白菜素藥用植物DNA條形碼的鑒定研究 [J]. 華西藥學雜志, 2021, 36(1): 44-50.

[21] 李笑, 譚朝陽, 徐德宏, 等. 益母草植物DNA條形碼的鑒定研究 [J]. 中國藥師, 2020, 23(3): 442-447.

[22] 趙莉莉. 花椒屬植物DNA條形碼研究 [D]. 楊凌: 西北農林科技大學, 2018.

[23] 許子欣, 冉志芳, 楊小彤, 等. 基于psbA-trnH和rDNA ITS序列的不同地理居群巴戟天聚類分析 [J]. 南方農業學報, 2018, 49(12): 2364-2370.

DNA barcoding sequences and cluster analysis of 10 species of

CHANG Jing-ru, YAO Xuan-hang, ZHANG Xue-wei, ZHOU Yi, LIU Cui-jing, LIU Xia

State Key Laboratory of Ecological Restoration and Ecosystem Management, College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

To provide theoretical basis for species classification and phylogenetic relationship ofby analyzing ITS2, matk, rbcL, psbA barcodes of 10 species ofgrown in Jilin Province.Based on 30 samples of 10 species of, genomic DNA was extracted and amplified by PCR and bi-directionally sequenced with ITS2, matk, rbcL and psbA as barcode sequences. The sequence results were corrected and cluster analysis was carried out.Each of four fragments of ITS2, matk, rbcL and psbA could not identify all 10 plants, but only some plants, eg.var.,,,,,,and. From the results of cluster analysis, withas the outer group,was a single branch in 10 species,andwere one branch,,andwere one branch,,var.andwere one branch, and they were closely related to. The result of cluster analysis was consistent with the traditional classification of 10 species ofL. in.The combination of ITS2＋rbcL＋psbA could identify eight species of. Ten species ofgrown in Jilin Province are divided into five branches by cluster analysis,which is consistent with the traditional classification of 10 species ofin.

L.; DNA barcoding; cluster analysis; genetic relationship;(Fisch.) Bung;Bunge var.(Bunge) Hsiao;Bunge;Jacquin;Bunge;L. F.;Pall.;Bunge;(Pall.) DC.;P.Y. Fu et Y. A. Chen

R286.12

A

0253 - 2670(2022)22 - 7201 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.024

2022-03-06

吉林省科技廳科技支撐計劃-重點項目（20200404003YY）

常晶茹（1997—），女，碩士研究生，研究方向為野生動植物保護與利用。Tel: 15143556401 E-mail: 1220982884@qq.com

劉 霞（1965—），女，博士，副教授，主要從事中藥資源與栽培研究。E-mail: liuxia506@jlau.edu.cn

[責任編輯 時圣明]