紅小米黃酒心肌保護作用及活性成分研究

李 爽，陳林玉，王東浩，李英梅，劉藤藤，婁舒奇，畢躍峰

紅小米黃酒心肌保護作用及活性成分研究

李 爽，陳林玉，王東浩，李英梅，劉藤藤，婁舒奇，畢躍峰*

鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001

選用2種河南南陽紅小米黃酒和1種糯米黃酒，對比研究其心肌保護作用及紅小米黃酒活性成分。采用過氧化氫作用于心肌細胞，建立氧化應(yīng)激損傷模型，CCK-8法測定細胞活力；比色法測定細胞乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶和丙二醛的含量。利用普魯士藍顯色法和亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定了總酚酸、總黃酮含量以及相關(guān)營養(yǎng)成分含量。并采用硅膠、ODS等柱色譜方法，結(jié)合各種波譜分析技術(shù)，對紅小米黃酒中的化學成分進行了系統(tǒng)研究。3種黃酒對過氧化氫氧化損傷心肌細胞均有一定程度的保護作用，特別是紅小米黃酒作用顯著；從紅小米黃酒中分離得到了17個化合物，主要為酚酸類和黃酮類化合物，含量測定結(jié)果表明紅小米黃酒中總酚酸、總黃酮及γ-氨基丁酸含量均最高。紅小米黃酒對氧化損傷細胞具有良好的保護作用，其主要活性成分為總酚酸、總黃酮及γ-氨基丁酸。

紅小米黃酒；心肌保護；含量測定；總酚酸；總黃酮；γ-氨基丁酸

黃酒是世界上最古老的酒種之一，與葡萄酒、啤酒合稱為“世界三大古酒”。研究表明，黃酒含有酚酸、氨基酸、醇和酯類等成分[1]，因其營養(yǎng)豐富，素有“液體蛋糕”的美譽。黃酒性溫，具有活氣血、通經(jīng)脈、保護心血管等作用，也常作為中藥炮制輔料用于改善藥性。但目前研究較多的是南方黃酒，主要包括浙江紹興黃酒、福州紅曲黃酒等，大多以糯米為原料[2]。北方黃酒多以小米為原料，其中南陽黃酒以紅小米為原料，風味獨特，具有很高的營養(yǎng)價值，為河南南陽特色產(chǎn)業(yè)，但關(guān)于紅小米黃酒心肌保護作用及活性成分系統(tǒng)研究尚未見報道。通過文獻查詢，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，它參與多種代謝活動，能對抗多種實驗性心律失常[3]，具有較好的生理活性；磷（P）參與機體多種生理活動，是使心臟有規(guī)律地跳動、維持腎臟正常機能和傳達神經(jīng)刺激的重要物質(zhì)，提示二者可能為紅小米黃酒中與心肌保護相關(guān)的營養(yǎng)成分。

本實驗利用H9c2細胞的過氧化氫（H2O2）損傷模型，通過測定細胞活力、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量等指標，從細胞水平上探討紅小米紅曲黃酒[CRW-XY(RK)]、紅小米黃酒（CRW-XY）和紹興糯米麥曲黃酒（CRW-SX）對氧化損傷細胞的保護作用，發(fā)現(xiàn)CRW-XY對心肌細胞的保護作用最好。并對3種黃酒主要成分總酚酸、總黃酮、相關(guān)營養(yǎng)成分γ-氨基丁酸和磷進行了含量測定及比較分析。再采用硅膠、ODS等柱色譜方法，結(jié)合各種波譜分析技術(shù)，對CRW-XY中的化學成分進行了系統(tǒng)研究，以期為CRW-XY質(zhì)量標準體系的建立提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2550紫外-分光光度計（日本島津公司）；SW-CJ-2D超凈工作臺（蘇州名牌之星儀器有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；37XB倒置顯微鏡（上海光學儀器五廠）；Research plus多功能酶標儀（美國Bio Tek公司）。

1.2 樣品與試劑

CRW-XY(RK)（批號20200805）、CRW-XY（批號20200807）均購自河南省南陽市新野縣，古越龍山沈永和陳年黃酒CRW-SX（批號20200822）購自浙江省紹興市；樣品目前保存于鄭州大學藥學院實驗室。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

H9c2心肌細胞系（CRL-1446TM）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

對照品沒食子酸（批號110831-201906）、蘆丁（批號100080-201811）質(zhì)量分數(shù)均為94.2%，購自于中國食品藥品檢定研究院；陽性藥白藜蘆醇（resveratrol，北京索萊寶科技有限公司，貨號R8350）；LDH測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；總蛋白定量試劑盒（BCA法）、MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒、GSH測定試劑盒（南京建成生物公司）；CCK-8試劑盒（鄭州德雅有限公司）。

2 方法

2.1 3種黃酒心肌保護作用研究

2.1.1 H9c2心肌細胞培養(yǎng)、分組與模型建立 將H9c2細胞置于CO2培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）進行培養(yǎng)，當細胞數(shù)量達到80%以上時，使用血球計數(shù)板對細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度，以5×103個/孔接種于96孔板。將培養(yǎng)好的H9c2心肌細胞分為對照組、H2O2組、陽性藥組、給藥組（55 ℃減壓濃縮下所得黃酒浸膏）。對照組不給予任何處理正常培養(yǎng)H9c2心肌細胞；H2O2組給予300 μmol/L處理正常培養(yǎng)的H9c2心肌細胞；陽性藥組加入200 μL的10 μmol/L的白藜蘆醇溶液；給藥組分別加入200 μL不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0 mg/mL）黃酒溶液。每組每個質(zhì)量濃度均設(shè)6個復(fù)孔。加樣作用24 h后，除對照組，棄去原培養(yǎng)基，加入200 μL 300 μmol/L H2O2溶液，培養(yǎng)2 h，可觀察到細胞形態(tài)出現(xiàn)皺縮，折光率減小以及細胞空泡化，即為H2O2氧化應(yīng)激模型[4]。

2.1.2 CCK-8法測定細胞活力 棄去原培養(yǎng)基，每孔中加入200 μL配好的CCK-8溶液，搖勻后CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）孵育4 h，450 nm下檢測各孔吸光度（）值。

2.1.3 抗氧化指標的測定 將H9c2細胞接種于6孔板內(nèi)，細胞密度為30×104個/孔，分組及藥物處理同“2.1.1”項。2 mL 500 μmol/L的H2O2作用心肌細胞2 h后，收集細胞培養(yǎng)基，標記好組別，用于LDH活力檢測（胞外）。細胞用PBS清洗2次，400 μL胰蛋白酶進行消化，4 ℃、3500 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。加入500 μL 4 ℃預(yù)冷的PBS，冰浴條件下超聲破碎細胞，4 ℃、3500 r/min離心5 min，取上清檢測LDH活力（胞內(nèi)）。MDA、SOD、GSH含量的計算均以蛋白含量為基礎(chǔ)，蛋白含量測定采用BCA法，以上抗氧化指標的測定均使用試劑盒檢測，所有操作嚴格按說明書進行。

2.2 總酚酸及總黃酮含量測定

測定CRW-XY(RK)、CRW-XY中總酚酸和總黃酮含量，同時對比CRW-SX，采用普魯士藍顯色法[5-6]測定總酚酸含量，亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[7]測定總黃酮含量。

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸和蘆丁對照品適量，分別用甲醇和70%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至量瓶，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 3種黃酒各精密量取適量體積，55 ℃減壓濃縮至恒定質(zhì)量，得總浸膏，精密稱取3種黃酒總浸膏各100 mg，用70%乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的供試品溶液。

2.2.3 總酚酸測定的方法學考察

（1）線性關(guān)系考察：采用普魯士藍顯色法[5-6]測定總酚酸含量，精密移取沒食子酸對照品溶液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL于25 mL量瓶，加入5 mL甲醇、2 mL SDS溶液及1 mL FeCl3-K3[Fe(CN)6] 混合溶液，暗處靜置5 min；鹽酸溶液定容，搖勻，靜置20 min，在743 nm處測定吸光度（）。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），值為縱坐標（），進行線性分析，得線性方程＝0.035 4＋0.009 1，2＝0.999 5，結(jié)果表明沒食子酸在5～30 μg線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗：吸取0.10 mL供試品溶液，測定值，重復(fù)操作6次，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明此試驗精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：吸取0.10 mL供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h測定值，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）重復(fù)性試驗：精密稱取6份樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取0.10 mL，測定值，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明此方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗：分別吸取6份0.05 mL供試品溶液及0.10 mL對照品溶液，于25 mL量瓶中，顯色后測定值。計算加樣回收率，CRW-XY(RK)、CRW-XY和CRW-SX的平均加樣回收率分別為99.84%、99.39%、99.55%，3個樣品RSD值均小于3.0%，說明此方法的回收率良好。

2.2.4 總黃酮測定的方法學考察

（1）線性關(guān)系考察：亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[7]測定總黃酮含量，精密移取蘆丁對照品溶液0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL于25 mL量瓶中，依次加入5 mL乙醇，1 mL NaNO2溶液，搖勻，暗處靜置6 min。加入1 mL Al(NO3)3溶液，暗處靜置6 min。加入10 mL NaOH溶液，乙醇定容，搖勻，暗處靜置15 min，在356 nm處測定值。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（），為縱坐標（），進行線性分析，得線性方程＝0.008 5－0.003 7，2＝0.999 6，結(jié)果表明蘆丁在20～120 μg線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗：分別吸取3種供試品溶液0.10 mL，測定值，重復(fù)操作6次，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明此試驗精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：吸取0.10 mL供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h測定值，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）重復(fù)性試驗：精密稱取6份樣品按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。精密吸取0.10 mL，測定值，結(jié)果3個樣品RSD均小于2%，說明此方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗：分別吸取6份0.05 mL供試品溶液及0.40 mL對照品溶液于25 mL量瓶，顯色后測定吸光度。計算加樣回收率，CRW-XY(RK)、CRW-XY和CRW-SX的平均加樣回收率分別為99.72%、99.68%、99.79%，3個樣品RSD值均小于2.0%，說明此方法回收率良好。

2.3 相關(guān)營養(yǎng)成分測定

測定CRW-XY(RK)、CRW-XY中相關(guān)營養(yǎng)成分含量，同時對比CRW-SX。氨基酸含量測定參考《食品中氨基酸的測定（GB 5009.124-2016）》進行[8]；微量元素磷的含量測定參考GB 5009.87-2016進行。

2.4 CRW-XY分離與結(jié)構(gòu)鑒定

量取2 L CRW-XY，55 ℃減壓濃縮，得總浸膏（62.3 g）。取35.0 g總浸膏，6倍量甲醇重復(fù)萃取7次，得CRW-XY甲醇部位浸膏（CRW-A，29.6 g），得膏率為84.57%。CRW-A采用硅膠柱色譜（200～300目，110 cm×20 cm），二氯甲烷-醋酸乙酯（2∶1）、醋酸乙酯-95%乙醇-水（10∶2∶1、8∶2∶1）及醋酸乙酯-甲醇-30%甲酸水溶液（6∶2∶1.5）梯度洗脫，TLC分析合并得到10個組分Fr. 1～10。

Fr. 1（8.26 g）經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-丙酮（4∶1）洗脫，TLC分析合并得5個組分Fr. 1a～1e。Fr. 1c反復(fù)經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇（5∶1）及石油醚、甲醇重結(jié)晶，得到化合物1（10.14 mg）、2（9.28 mg）、3（16.78 mg）。Fr. 1b經(jīng)硅膠柱色譜石油醚-醋酸乙酯（12∶1），乙醇重結(jié)晶得化合物5（37.76 mg），此組分再經(jīng)硅膠柱色譜石油醚-二氯甲烷（1∶1），得到化合物7（12.97 mg）。Fr. 1d經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-醋酸乙酯-甲酸（5∶3∶1），甲醇重結(jié)晶得到化合物6（12.42 mg）、13（15.33 mg）。

Fr. 3（1.26 g）經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（10∶1、5∶1）梯度洗脫，TLC分析合并得2個組分Fr. 3a～3b。Fr. 3a經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜[甲醇-水（2∶8、3∶7）]洗脫，得到化合物12（11.24 mg）、14（8.99 mg）。

Fr. 4（2.30 g）經(jīng)ODS柱色譜[甲醇-水（100∶1→1∶100）]梯度洗脫，得7個組分Fr. 4a～4g。Fr. 4b（582.17 mg）經(jīng)硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（3∶1）洗脫，得到化合物4（96.11 mg）、17（10.01 mg）。Fr. 4f（575.57 mg）反復(fù)Sephadex LH-20凝膠柱色譜[甲醇-水（2∶8）]、硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物8（36.95 mg）、9（27.33 mg）。

Fr. 7（369.75 mg）經(jīng)硅膠柱色譜醋酸乙酯-95%乙醇-水（6∶2∶1）洗脫，TLC分析合并得3個組分Fr. 7a～7c。Fr. 7c經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（3∶1、1∶1）梯度洗脫，得到化合物10（11.52 mg）。

Fr. 9（3.10 g）經(jīng)硅膠柱色譜醋酸乙酯-水-甲酸（8∶1∶1），反復(fù)用乙醇重結(jié)晶及沉淀法，得到化合物11（47.86 mg）、16（20.72 mg）。

Fr. 10（3.10 g）經(jīng)硅膠柱色譜，醋酸乙酯-水-甲酸（8∶1∶1、6∶1∶1）梯度洗脫，得到化合物15（17.53 mg）。

3 結(jié)果

3.1 心肌保護作用

3.1.1 細胞活力檢測 3種黃酒分別給藥0.1、0.5、1.0 mg/mL，CCK-8法檢測細胞活力結(jié)果見圖1。與對照組比較，H2O2組細胞生存率顯著降低（＜0.05），說明模型建立成功。與H2O2組相比，RES（10 μmol/L）及3種黃酒（1.0 mg/mL）對細胞預(yù)處理后，細胞生存率顯著升高（＜0.05），說明其均有一定預(yù)防H2O2氧化應(yīng)激作用。其中CRW-XY在1.0 mg/mL時效果最佳，接近于陽性藥白藜蘆醇。

3.1.2 抗氧化指標的測定結(jié)果 按試劑盒說明書檢測LDH漏出率，結(jié)果見圖2。與對照組比較，H2O2組細胞LDH漏出率顯著升高，但在給RES（10 μmol/L）及3種黃酒（1.0 mg/mL）對細胞預(yù)保護之后，漏出率有所降低（＜0.05），具有統(tǒng)計學意義，說明RES及3種黃酒對H2O2氧化應(yīng)激反應(yīng)可以起到一定預(yù)防作用，其中CRW-XY預(yù)防效果最好。

按試劑盒說明書檢測MDA、SOD及GSH含量，結(jié)果見圖3。與對照組比較，H2O2組細胞MDA含量顯著升高（＜0.001），說明模型建立成功；與H2O2組相比，RES（10 μmol/L）及各給藥組（1.0 mg/mL）MDA含量均有一定降低，特別是CRW-XY在1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下，MDA降低至3.22 nmol/mg，接近于RES。與對照組相比，H2O2組細胞SOD及GSH含量顯著降低（＜0.01），說明模型建立成功；與H2O2組相比，RES（10 μmol/L）及各給藥組（1.0 mg/mL）SOD及GSH含量升高，說明3種黃酒均有一定預(yù)防H2O2氧化應(yīng)激作用，特別是CRW-XY在1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下，預(yù)防效果接近于RES。

圖2 不同濃度黃酒對H2O2致H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激細胞LDH漏出率影響

3.2 總酚酸測定結(jié)果

分別吸取0.10 mL的供試品溶液，測定值，根據(jù)線性方程計算樣品含量，結(jié)果見表1，表明CRW-XY總酚酸含量最高。

圖3 黃酒對H2O2損傷H9c2心肌細胞內(nèi)MDA (A)、SOD (B) 及GSH (C) 含量的影響

3.3 總黃酮測定結(jié)果

分別吸取0.10 mL的供試品溶液，測定值，根據(jù)線性方程計算樣品含量，結(jié)果見表2。3個樣品RSD值均小于2.0%，結(jié)果表明CRW-XY總黃酮含量最高。

表1 樣品總酚酸含量測定結(jié)果()

表2 樣品總黃酮含量測定結(jié)果()

3.4 相關(guān)營養(yǎng)成分結(jié)果分析

γ-氨基丁酸和P都具有保護心臟作用，可對抗多種心律失常。本實驗對3種黃酒中與心肌保護作用相關(guān)的營養(yǎng)成分γ-氨基丁酸和P進行含量測定，結(jié)果見表3。表明CRW-XY中的γ-氨基丁酸含量最高，P含量相對較高，提示二者也為CRW-XY心肌保護作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.5 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從CRW-XY中共分離得到17個化合物，分別進行結(jié)構(gòu)確證。

表3 3種黃酒中相關(guān)營養(yǎng)成分含量測定結(jié)果

同行上標字母不同表示差異顯著（＜0.05）

significant differences are indicated by different superscript letters of the counterparts（< 0.05）

化合物1：淡黃色粉末，mp 89～92 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，提示該物質(zhì)為酚類物質(zhì)。ESI-MS/137.1 [M－H]?，分子式為C8H10O2。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 8.10 (1H, s, -OH), 7.09 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.78 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 4.77 (1H, s, 8-OH), 3.82 (2H, d,= 6.5 Hz, H-8), 2.79 (2H, d,= 6.5 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 154.3 (C-4), 133.6 (C-1), 130.2 (C-2, 6), 115.5 (C-3, 5), 63.8 (C-8), 38.2 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[9-10]，鑒定化合物1為對羥基苯乙醇。

化合物2：白色針晶（石油醚），mp 168～172 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，溴酚藍顯色為黃色，提示該物質(zhì)為酚酸類物質(zhì)。ESI-MS/195.0 [M＋H]+，分子式為C10H10O4。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.56 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.14 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 7.02 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6), 6.77 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.27 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 3.85 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (100 MHz, MeOD): 171.0 (-COOH), 150.5 (C-4), 149.4 (C-3), 146.9 (C-7), 127.8 (C-1), 124.0 (C-6), 116.5 (C-8), 115.9 (C-2), 111.7 (C-5), 56.4 (-OCH3)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[11-12]，鑒定化合物2為阿魏酸。

化合物3：白色針晶（甲醇），mp 211～213 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，溴酚藍顯示陽性，提示該物質(zhì)為酚酸類物質(zhì)。ESI-MS/181.1 [M＋H]+，分子式為C9H8O4。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.53 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.03 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.93 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.22 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 171.2 (-COOH), 149.6 (C-4), 147.2 (C-3), 146.9 (C-7), 127.9 (C-1), 123.0 (C-6), 116.6 (C-5), 115.7 (C-8), 115.2 (C-2)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[13-14]，鑒定化合物3為咖啡酸。

化合物4：無色針晶（甲醇），mp 118～120 ℃，硅膠板檢識，乙醇-濃硫酸顯色加熱呈紫紅色。ESI-MS/121.1 [M－H]?，分子式為C4H10O4。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 3.70 (2H, dd,= 10.3, 5.0 Hz, H-2, 3), 3.58 (8H, ddd,= 17.5, 11.4, 5.3 Hz, 1, 2, 3, 4-OH, H-1, 4,)。13C-NMR (100 MHz, MeOD): 73.6 (C-2, 3), 64.0 (C-1, 4)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[15-16]，鑒定化合物4為赤蘚糖醇。

化合物5：無色片狀結(jié)晶（乙醇），mp 300 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，提示該物質(zhì)為酚類物質(zhì)。ESI-MS/109.0 [M－H]?，分子式為C6H6O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 8.81 (2H, s, H-1, 2), 6.74 (2H, m, H-3, 6), 6.61 (2H, m, H-4, 5)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 145.4 (C-1, 2), 119.4 (C-4, 5), 115.8 (C-3, 6)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[17]，鑒定化合物5為兒茶酚。

化合物6：淡黃色粉末，mp 175～176 ℃，硅膠板檢識，AlCl3顯色后加熱，365 nm顯黃色熒光，提示該物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。ESI-MS/291.2 [M＋H]+，分子式為C15H14O6。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 6.84 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′ ), 6.76 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 6.72 (1H, dd,= 8.2, 1.9 Hz, H-6′), 5.92 (1H, d,= 2.3 Hz, H-6), 5.85 (1H, d,= 2.3 Hz, H-8), 4.56 (1H, d,= 7.5 Hz, H-2), 3.97 (1H, dd,= 13.2, 7.9 Hz, H-3), 2.85 (1H, dd,= 16.1, 5.4 Hz, H-4a), 2.50 (1H, dd,= 16.1, 8.2 Hz, H-4b)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 158.0 (C-7), 157.7 (C-5), 157.1 (C-9), 146.3 (C-3′, 4′), 132.4 (C-1′), 120.2 (C-6′), 116.2 (C-5′), 115.4 (C-2′), 101.0 (C-10), 96.4 (C-6), 95.6 (C-8), 82.9 (C-2), 69.0 (C-3), 28.7 (C-4)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[18-19]，鑒定化合物6為兒茶素。

化合物7：白色粉末，mp 205～209 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，溴酚藍顯陽性，提示該物質(zhì)為酚酸類物質(zhì)。ESI-MS/196.9 [M－H]?，分子式為C9H10O5。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.33 (1H, s, H-2, 6), 3.88 (6H, s, 8, 9-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 170.0 (C-7), 148.9 (C-3, 5), 120.8 (C-1), 108.3 (C-2, 6), 56.8 (C-8, 9)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[20-21]，鑒定化合物7為丁香酸。

化合物8：黃色粉末，mp 195 ℃，硅膠板檢識，AlCl3顯色后加熱，365 nm顯黃色熒光，提示該物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。ESI-MS/608.9 [M－H]?，分子式為C27H30O16。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.60 (1H, s, 5-OH), 7.54 (2H, m, H-2′, 6′), 6.84 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.38 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.34 (1H, d,= 7.4 Hz, H-1′′), 5.28 (1H, d,= 3.0 Hz, 2′-OH), 4.38 (1H, s, H-1′′′), 0.99 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 177.6 (C-4), 164.3 (C-7), 161.4 (C-5), 156.8 (C-2), 156.6 (C-9), 148.5 (C-4′), 144.9 (C-3′), 133.4 (C-3), 121.8 (C-1′), 121.2 (C-6′), 116.4 (C-5′), 115.3 (C-2′), 104.2 (C-10), 101.2 (C-1′′), 100.8 (C-1′′′), 98.8 (C-6), 93.7 (C-8), 76.6 (C-3′′), 76.1 (C-5′′), 74.2 (C-2′′), 72.0 (C-4′′′), 70.7 (C-3′′′), 70.5 (C-2′′′), 70.1 (C-4′′), 68.4 (C-5′′′), 67.2 (C-5′′), 17.9 (C-6′′′)。上述數(shù)據(jù)與文獻基本一致[22-23]，鑒定化合物8為蘆丁。

化合物9：黃色粉末，mp 314～317 ℃，硅膠板檢識，AlCl3顯色后加熱，365 nm顯黃色熒光，提示該物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。ESI-MS/300.9 [M－H]?，分子式為C15H10O7。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.73 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2′), 7.63 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5′), 6.39 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.18 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 177.2 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5 (C-5), 158.1 (C-9), 148.7 (C-2), 148.0 (C-4′), 146.1 (C-3′), 137.1 (C-3), 124.0 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.2 (C-5′), 116.0 (C-10), 104.5 (C-2′), 99.2 (C-8), 94.4 (C-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻基本一致[24-25]，鑒定化合物9為槲皮素。

化合物10：白色針晶（甲醇），mp 139～142 ℃，硅膠板檢識，乙醇-濃硫酸顯色加熱呈紫紅色。ESI-MS/397.5 [M＋H]+，分子式為C29H50O。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.35 (1H, s, H-6), 3.52 (1H, m, H-3), 1.01 (3H, s, H-19), 0.92 (3H, d,= 6.6 Hz , H-21), 0.85 (3H, d,= 7.7 Hz, H-29), 0.82 (3H, d,= 1.9 Hz, H-26), 0.80 (3H, d,= 6.9 Hz, H-27), 0.68 (3H, s, H-18)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 140.9 (C-5), 121.9 (C-6), 72.0 (C-3), 56.9 (C-14), 56.2 (C-17), 50.3 (C-9), 46.0 (C-24), 42.5 (C-4, 13), 39.9 (C-12), 37.4 (C-1), 36.7 (C-10), 36.3 (C-20), 34.1 (C-22), 32.1 (C-7), 31.8 (C-7), 31.7 (C-2), 29.3 (C-25), 28.4 (C-23), 26.3 (C-15), 24.5 (C-16), 23.2 (C-28), 21.2 (C-11), 20.0 (C-26), 19.6 (C-27), 19.2 (C-21), 18.9 (C-19), 12.1 (C-29), 12.0 (C-18)。上述數(shù)據(jù)與文獻基本一致[26-27]，鑒定化合物10為β-谷甾醇。

化合物11：白色無定形粉末，mp 228 ℃，硅膠板檢識，改良碘化鉍鉀顯黃色斑點，提示其含N原子；茚三酮乙醇顯色呈陽性，提示該化合物為氨基酸類或肽類化合物。ESI-MS/116.0 [M＋H]+，分子式為C5H9NO2。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 3.98 (1H, dd,= 8.8, 6.4 Hz, H-2), 3.38 (1H, m, H-3), 3.24 (1H, m, H-3), 2.30 (1H, m, H-5), 2.11 (1H, m,= 13.3, 6.3 Hz, H-5), 1.97 (2H, m, H-4)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 174.1 (C-1), 62.6 (C-2), 47.0 (C-3), 30.4 (C-5), 25.1 (C-4)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[28]，鑒定化合物11為脯氨酸。

化合物12：白色針晶（甲醇），mp 197～200 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6]顯色為藍色，溴酚藍顯黃色斑點，提示該化合物為酚酸類物質(zhì)。ESI-MS/152.9 [M－H]?，分子式為C7H6O4。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.41 (2H, m, H-2, 6), 6.78 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 170.4 (C-7), 151.7 (C-4), 146.2 (C-3), 124.0 (C-6), 123.3 (C-1), 117.3 (C-2), 115.7 (C-5)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[29-30]，鑒定化合物12為原兒茶酸。

化合物13：白色結(jié)晶（甲醇），mp 240 ℃，硅膠板檢識，AlCl3顯色加熱，365 nm顯黃色熒光，提示該物質(zhì)為黃酮類物質(zhì)。ESI-MS/:291.1 [M＋H]+，分子式為C15H14O6。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 6.98 (1H, d,= 1.8 Hz, H-2′), 6.76 (1H, d,= 2.7 Hz, H-6′), 6.65 (1H, dd,= 5.9, 3.5 Hz, H-5′), 5.94 (1H, s, H-8), 5.92 (1H, s, H-6), 4.82 (1H, s, H-2), 4.18 (1H, s, H-3), 2.86 (1H, dd,= 16.7, 4.6 Hz, H-4a), 2.74 (1H, dd,= 16.8, 2.8 Hz, H-4b)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 158.2 (C-7), 157.8 (C-5), 157.5 (C-9), 146.1 (C-3′), 145.9 (C-4′), 132.4 (C-1′), 121.1 (C-6′), 116.0 (C-5′), 115.4 (C-2′), 100.2 (C-10), 96.5 (C-6), 96.0 (C-8), 80.0 (C-2), 67.6 (C-3), 29.4 (C-4)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[31-32]，鑒定化合物13為表兒茶素。

化合物14：白色結(jié)晶（醋酸乙酯），mp 210 ℃，硅膠板檢識，F(xiàn)eCl3-K3[Fe(CN)6] 顯色為藍色，溴酚藍顯示陽性，提示該物質(zhì)為酚酸類物質(zhì)。ESI-MS/352.9 [M－H]?，分子式為C16H18O9。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 7.56 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.05 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.95 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.26 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 5.33 (1H, m, H-5′), 4.17 (1H, dd,= 6.3, 3.3 Hz, H-4′), 3.73 (1H, dd,= 8.5, 3.2 Hz, H-3′), 2.15 (4H, m, H-2′, 6′)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 177.2 (C-7′), 168.8 (C-9), 149.7 (C-4), 147.2 (C-7), 147.0 (C-3), 127.9 (C-1), 123.1 (C-6), 116.6 (C-5), 115.4 (C-8), 76.3 (C-1′), 73.6 (C-3′), 72.1 (C-4′), 71.4 (C-5′), 38.9 (C-2′), 38.4 (C-6′)。上述數(shù)據(jù)與文獻基本一致[33-34]，鑒定化合物14為綠原酸。

化合物15：白色片狀晶體（乙醇），mp 300 ℃，硅膠板檢識，改良碘化鉍鉀顯黃色斑點，提示其含N原子；茚三酮乙醇顯色呈陽性，提示該化合物為氨基酸類化合物。ESI-MS/132.0 [M－H]?，分子式為C4H7NO4。1H-NMR (400 MHz, D2O): 4.08 (1H, dd,= 6.9, 4.6 Hz, H-2), 3.00 (2H, m, H-3)；13C-NMR (100 MHz, D2O): 174.3 (C-1), 172.9 (C-4), 50.7 (C-2), 34.6 (C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[35]，鑒定化合物15為天冬氨酸。

化合物16：白色片狀晶體（乙醇），mp 215 ℃，硅膠板檢識，改良碘化鉍鉀顯黃色斑點，提示其含N原子；茚三酮乙醇顯色呈陽性，提示該化合物為氨基酸類化合物。ESI-MS/147.0 [M＋H]+，分子式為C6H14N2O2。1H-NMR (400 MHz, D2O): 3.38 (1H, t,= 6.3 Hz, H-1), 2.95 (2H, m, H-5, 5′), 1.67 (4H, m, H-2, 4, 2′, 4′), 1.40 (2H, m, H-3, 3′)；13C-NMR (100 MHz, D2O): 180.7 (-COOH), 55.3 (C-2), 39.3 (C-6), 32.7 (C-5), 27.0 (C-4), 21.8 (C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[36]，鑒定化合物16為賴氨酸。

化合物17：白色結(jié)晶粉末，mp 94～98 ℃，硅膠板檢識，乙醇-濃硫酸噴霧后加熱呈紫紅色。ESI-MS/143.0 [M－H]?，分子式為C10H8O。1H-NMR (400 MHz, MeOD): 8.23 (1H, m, H-8), 7.72 (1H, dd,= 6.2, 3.2 Hz, H-5), 7.39 (2H, m, H-6, 7), 7.27 (2H, m, H-3, 4), 6.84 (1H, dd,= 7.3, 1.1 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, MeOD): 154.5 (C-1), 136.4 (C-10), 128.5 (H-5), 127.2 (C-6), 127.1 (C-3), 126.4 (C-7), 125.6 (C-9), 123.2 (C-8), 120.2 (C-4), 109.0 (C-2)。上述數(shù)據(jù)與文獻基本一致[37]，鑒定化合物17為α-萘酚。

4 討論

本實驗研究了3種黃酒的心肌保護作用及CRW-XY活性成分。以細胞生存率、LDH漏出率、MDA、SOD及GSH為指標，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇及各給藥組均能一定程度升高細胞生存率、降低LDH漏出率及MDA含量并升高SOD及GSH含量，說明3種黃酒對H2O2氧化應(yīng)激損傷細胞有不同程度的保護作用，特別是CRW-XY在1.0 mg/mL下效果最好，均接近于白藜蘆醇。對其活性成分進行了進一步研究，從中分離得到了17個化合物，主要為酚酸類和黃酮類物質(zhì)，鑒于2類物質(zhì)具有很強的抗氧化性[38]，本研究測定了3種黃酒中總酚酸、總黃酮及相關(guān)營養(yǎng)成分γ-氨基丁酸含量，結(jié)果表明CRW-XY中2類物質(zhì)含量明顯高于其他2種黃酒，與其心肌保護作用最好相印證。

本研究表明CRW-XY對氧化損傷細胞具有良好的保護作用，并與黃酒的酵曲和原料具有一定相關(guān)性，研究為黃酒質(zhì)量標準體系建立、CRW-XY品質(zhì)進一步提升及黃酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供了科學依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cardioprotective effects and active components of red millet Huangjiu

LI Shuang, CHEN Lin-yu, WANG Dong-hao, LI Ying-mei, LIU Teng-teng, LOU Shu-qi, BI Yue-feng

Pharmacy College, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China

In this paper, two kinds of Henan Nanyang red millet Huangjiu and one kind of glutinous Huangjiu were selected to compare and study their myocardial protective effects and active components of red millet Huangjiu.The oxidative stress injury model was established by applying hydrogen peroxide (H2O2) to cardiomyocytes. The cell viability was measured by CCK-8 assay; The levels of cellular lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were measured colorimetrically. The contents of total phenolic acids, total flavonoids, as well as related nutritional components were determined using the Prussian blue chromogenic method and the sodium nitrite aluminum nitrate sodium hydroxide chromogenic method. A systematic study of the chemical constituents in red millet Huangjiu was carried out using column chromatography methods such as silica gel and ODS, combined with various spectroscopic techniques.All 3 kinds of Huangjiu exhibited some degree of protection on cardiomyocytes from oxidative damage by H2O2, especially the red millet Huangjiu exhibited significant protection. A total of 17 compounds, mainly phenolic acids and flavonoids, were isolated from red millet Huangjiu. The results of content determination showed that the red millet Huangjiu had the highest contents of total phenolic acids, total flavonoids as well as γ-aminobutyric acid.Red millet Huangjiu has a good protective effect on the cells damaged by oxidation, and its main active components were total phenolic acid, total flavonoids and γ-aminobutyric acid.

red millet Huangjiu;myocardial protection;content determination; total phenolic acid; total flavonoids; γ-aminobutyric acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)22 - 7010 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.004

2022-07-14

李 爽（1998—），女，在讀碩士研究生，專業(yè)方向為藥學。E-mail: lis0801@163.com。

畢躍峰，女，博士后，教授，研究生導師，研究方向為中藥作用物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制研究及新藥研究開發(fā)。Tel: 13939091607 E-mail: 2000byf@sina.com

[責任編輯 王文倩]