基于宏基因測序的微生物飼料添加劑菌群結構及質量分析

李 明，饒正華，梁洺源，張軍民

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所中心實驗室，北京 100193）

隨著飼料端全面禁抗，養殖端進入減抗、限抗時代，微生物飼料添加劑產業迎來了新的機遇。但是由于在生產過程中控制不嚴，其他微生物的污染問題成為影響產品質量的重要安全隱患。目前，對微生物飼料添加劑產品中污染菌，如沙門氏菌、大腸菌群、葡萄球菌、產氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌等的檢測，主要用平板計數、最大或然計數法等常規方法，這些方法都是有明確的檢測目標，而對于非目標，卻往往無法檢出。如果要全面了解產品中菌的情況，需要對每種菌都進行檢測；細菌總數、霉菌總數等也只是一個相對的概念并且不能進行分類。因此，常規分析方法不僅費時費力，而且不能全面分析產品中的菌群和含量。

宏基因組學技術是基于生境中所有微生物總DNA序列，分析其菌群結構的重要檢測方法，可全面分析樣品中含有的微生物種類和其相對含量，被廣泛應用于食品（Li等，2020；Huang等，2017；Coughlan等，2015）、環境（Zhou等，2021；Schages等，2021；Nagarkar等，2021）、 腸 道（Chaitra等，2021；Wang等，2020a；Wang等，2020b）等。本研究利用宏基因組學技術對4年采集的113個微生物飼料添加劑樣品進行菌群結構分析，旨在闡明微生物飼料添加劑產品目前存在的問題、污染頻率較高的微生物、生產中引起微生物污染風險的關鍵環節及應對策略，為微生物飼料添加劑產品的質量控制和行業監管提供數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 研究對象 本試驗的研究對象為2018年至2021年采集的市售微生物飼料添加劑，共113個樣品。

1.1.2 主要試劑及儀器DNA提取試劑：參照Yu等（2004）方法自行配制；文庫構建試劑盒Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina，北京全式金生物技術有限公司。

Thermo微量移液器、5810R小型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；GR 60DA高壓滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；Qubit 3.0核酸熒光定量儀，美國ThermoFisher Scientific公司；Illumina Hiseq 3000基因測序平臺，美國Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 取0.05 g樣品于離心管中，加入5~20粒氧化鋯珠和1 mL的裂解液，振蕩研磨儀振蕩3 min。70℃水浴15 min。12000 r/min離心15 min，轉移上清液至新的離心管，加入10 μL的RNA酶A溶液，37℃孵育15 min。加入20 μL的蛋白酶K溶液，70℃孵育10 min。加入200 μL的PEG溶液和100 μL的核酸吸附磁珠懸液，室溫靜置10 min，磁力架靜置吸附1 min，棄上清液。70%的乙醇漂洗2次。加入100 μL的純水洗脫DNA。Qubit 3.0核酸熒光定量儀檢測DNA的濃度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整度。

1.2.2 宏基因組文庫構建與測序 利用全式金建庫試劑盒，按照說明書進行文庫制備。Illumina Hiseq 3000測序平臺（北京貝瑞和康生物技術有限公司）進行宏基因組測序。

1.2.3 下機數據質控 利用fastp v0.12.4（Chen等，2018）對宏基因組下機數據進行質控，刪除N堿基含量超過10%或Q值小于5的堿基超過50%的序列。

1.2.4 物種注釋和定量 利用Kraken2 v2.0.8（Wood等，2019）將質控后的數據與Kraken數據庫進行序列比對，完成種屬分類。利用Bracken v2.5（Lu等，2017）對注釋結果進行統計，計算每種微生物的相對含量。

2 結果

2.1 菌群結構分析 通過對113個微生物飼料添加劑樣品進行菌群結構分析，即分析樣品中包含的菌種及其相對含量，發現產品主要存在檢測菌種與標識不符、使用《飼料添加劑品種目錄》（以下簡稱《目錄》）外功能菌、目標菌含量偏低、部分產品存在雜菌甚至致病菌的問題。

2.1.1 菌種與產品標識不符 如圖1所示，編號23產品的菌群結構主要為74.59%的副地衣芽孢桿菌、17.22%的卷曲乳桿菌和3.14%的地衣芽孢桿菌。其產品標識的菌種為地衣芽孢桿菌，說明該產品使用的菌種與標識不符。

圖1 編號23產品的菌群結構

2.1.2 使用《目錄》外功能菌 如圖2所示，編號95產品的菌群結構主要為35.39%的貝萊斯芽孢桿菌、30.59%的解淀粉芽孢桿菌、15.89%的枯草芽孢桿菌、6.13%的萎縮芽孢桿菌、2.86%的芽孢桿菌Lzh-5和2.4%的芽孢桿菌病毒Φ29。值得注意的是，貝萊斯芽孢桿菌具有生物降解功能（Deng等，2022；Liu等，2022；Ullah等，2021）和 抑 菌 作 用（Zhang等，2021a；Yan等，2021a；Wang等，2021a），解淀粉芽孢桿菌更多的報道為產生抗菌成分（Yan等，2021b；Yan等，2021c；Wang等，2021b）與治療致病菌引起的動植物疾病（Zhang等，2021b；Wang等，2021c；Wang等，2021d），屬于藥用范疇，而這兩種菌是否具有提高動物生產性能的作用，卻鮮有報道，因此，這兩種菌并未納入《目錄》中。如認為添加屬于利用菌種的抗菌作用，則等同于直接向樣品中添加抗生素。

圖2 編號95產品的菌群結構

2.1.3 非致病菌污染 如圖3所示，編號71產品的菌群結構主要為戊糖片球菌、Y-01芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、IHB B 7164芽孢桿菌和屎腸球菌。其產品標識的菌種為戊糖片球菌，僅占34.26%，說明該產品標識菌的含量偏低。

圖3 編號71產品的菌群結構

2.1.4 致病菌污染 如圖4所示，編號43產品的菌群結構主要為地衣芽孢桿菌、卷曲乳桿菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、戊糖片球菌和棒狀乳桿菌。其中，肺炎克雷伯菌是一種常見的致病菌，說明該產品含有致病菌，存在致病性風險。

圖4 編號43產品的菌群結構

2.2 污染菌的統計學分析 通過對113個微生物飼料添加劑樣品進行污染菌的統計學分析，如表1所示，目前市售微生物飼料添加劑出現頻率較高的污染菌分別為貝萊斯芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、副地衣芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、解淀粉芽孢桿菌和卷曲乳桿菌。其中，貝萊斯芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌的污染頻率最高，占比12.82%。

表1 樣品中高頻污染菌

3 結論

本研究結果表明，利用宏基因學技術檢測微生物飼料添加劑的菌群結構，可有效檢測微生物飼料添加劑中的非靶向污染菌，使污染菌甚至致病菌通過一次實驗高通量檢出，克服了傳統靶向檢測方法只能檢測一種或一類特定培養條件的微生物的缺點。對微生物飼料添加劑產品的質量控制和行業監管具有重要參考意義。

4年持續分析的結果表明，微生物飼料添加劑產品存在檢測菌種與標識不符、目標菌含量偏低、部分產品存在雜菌甚至致病菌的問題。