桉樹枝癭姬小蜂體內兩種優勢細菌對桉樹組培苗葉片部分生理指標的影響

勞家鴻蔣騰洋劉光銳楊振德林億群李俊玨彭小團鄭琳柯丁芷柔

(1.廣西大學林學院，廣西 南寧 530004；2.廣西森林生態與保育重點實驗室，廣西 南寧 530004)

桉樹為桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyputs)植物，是我國南方重要的速生豐產樹種之一，具有適應性廣、抗逆性強、易種植、培育周期短等優點，在提高經濟效益和生態效益方面發揮著重要作用[1]。然而調查顯示，桉樹種植區的生物多樣性下降，害蟲的種類和數量迅速上升[2]。桉樹枝癭姬小蜂(Leptocybe invasaFisher＆La Salle)是近年來危害桉樹的一種重要外來入侵害蟲，隸屬膜翅目(Hymenoptera)姬小蜂科(Eulophidae)，成蟲可在桉樹嫩枝、葉柄及葉脈等處產卵并形成大量蟲癭，嚴重影響桉樹生長發育。研究表明，桉樹枝癭姬小蜂的形態和生理指標受溫度和寄主植物條件的顯著影響[3]，而桉樹能夠通過合成大量防御性次生代謝物和激活保護酶來抵御其持續危害[4－6]，因此，探討兩者間的互作機制，可為桉樹生產中有效防治該害蟲提供參考。

昆蟲體內伴生細菌作為與昆蟲關系密切的微生物，在昆蟲生長發育及繁殖過程中發揮著重要作用，是害蟲防治中尚未開發的一類重要生物資源[7]。研究表明，桉樹枝癭姬小蜂伴生細菌可以降解桉樹體內的某些防御物質，有助于桉樹枝癭姬小蜂克服桉樹抗性[8]。目前已有學者從桉樹枝癭姬小蜂體內分離出了17株不同的細菌菌株，分屬于厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)[9，10]。但尚未見關于這些伴生菌對桉樹生長發育和生理代謝影響的研究報道。組織培養是植物快繁的一種重要手段，可有效脫除植物所帶病毒，且具有成活率高、病蟲害少、節本高效等優勢，被越來越廣泛地應用于實際生產中[11]。本研究以桉樹枝癭姬小蜂體內兩株優勢細菌的菌液單獨或混合噴灑桉樹組培苗，通過比較葉片滲透調節物質含量、葉綠素含量、光合和葉綠素熒光參數的差異，初步分析這兩種細菌處理對桉樹生理代謝的影響，以期為闡明桉樹枝癭姬小蜂與寄主桉樹之間的互作關系及該害蟲的生物防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桉樹材料為巨園桉DH 201－2(E.grandis×E.tereticornis)的組培苗，高度為28.0～30.0 cm，地徑為0.4～0.5 cm，由廣西林業科學研究院提供。

供試細菌菌株為N14、E4，均由廣西森林生態與保育重點實驗室從桉樹枝癭姬小蜂體內分離保存，其中，前者被鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)，屬革蘭氏陰性菌，后者被鑒定為短小桿菌屬(Curtobacterium)，屬革蘭氏陽性菌。

1.2 試驗設計與處理方法

試驗于2021年10月在廣西大學林學教學實踐基地進行。設4個處理:CK(對照)，噴灑10 mL清水；N14，僅噴灑10 mL稀釋的N14菌液；E4，僅噴灑10 mL稀釋的E4菌液；N14＋E4，兩種菌液各5 mL混合后噴灑。每處理3個重復，每個重復1盆。

處理方法:將用固體培養基培養的N14和E4菌株菌液調節吸光度到0.5，稀釋50倍，根據試驗設計，均勻地噴灑在桉樹葉上，每隔2天噴灑一次，各處理每次噴灑10 mL，共噴3次，每次噴灑后進行套袋保濕處理。噴灑期間天氣晴好，3次噴灑結束后的7 d內只對組培苗基部淋水并進行常規管理，7 d后采集組培苗葉片用于各項指標測定。

1.3 測定項目與方法

采用Li－6400便攜式光合分析儀測定光合作用參數；采用調制葉綠素熒光成像系統IMAGINGPAM(上海澤泉科技股份有限公司)測定葉綠素熒光參數；采用研磨－分光光度計法測定葉綠素(Chl)含量；酸性茚三酮法測定脯氨酸(PRO)含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量；采用蒽酮－硫酸法測定可溶性糖(SS)含量；采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白(SP)含量[12]。

1.4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2019軟件進行數據統計和圖表繪制，采用SPSS 25.0軟件進行顯著性檢驗和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 桉樹葉片中滲透調節物質和MDA含量的變化

與CK相比，N14處理使桉樹葉片中的SS、SP、PRO、MDA含量顯著增加；而E4處理除使PRO顯著增加外，其余指標均降低，但僅SP降低顯著；N14＋E4處理除使PRO含量顯著增加外，其余指標均與對照差異不顯著(圖1)。噴灑菌液處理間比較，N14處理的4種物質含量均顯著高于E4處理；N14＋E4處理的4種物質含量均介于N14和E4處理之間，其中，SP和SS含量與兩種單菌處理均差異顯著，PRO含量與E4處理差異顯著，MDA含量與N14處理差異顯著。

圖1 不同處理下桉樹葉片中滲透調節物質和MDA含量變化

2.2 桉樹葉片中葉綠素含量的變化

葉綠素是主要的光合色素，其含量高低決定了植物光合階段對光能的捕獲能力，受環境、生物因子等多種因素影響。由圖2可知，E4處理下，桉樹葉片中的Chl a、Chl b、Chl a＋b含量及Chl a/b值最高，顯著高于其它處理；N14＋E4處理次之，除Chl b外均顯著高于N14處理，但與CK差異不顯著(Chl a除外)；N14處理的各指標最低，除Chl b含量外，其它指標均顯著低于CK(圖2)。

圖2 不同處理下桉樹葉片中葉綠素含量變化

2.3 桉樹葉片光合指標的變化

由表1可知，與CK相比，E4處理的Pn和WUE顯著升高，Ci顯著下降，Gs、Tr略高于CK，差異不顯著；N14處理的Pn、Gs、Tr、WUE均顯著低于CK，而Ci顯著高于CK；N14＋E4處理的Pn、Tr顯著低于CK，Ci和WUE顯著高于CK，Gs與CK差異不顯著。三個噴灑菌液處理間，除Tr、WUE外，各指標均差異顯著，且N14＋E4處理的各指標值介于N14和E4處理間。

表1 不同處理下桉樹葉片的光合指標

2.4 桉樹葉綠素熒光參數的變化

由表2可以看出，E4處理的最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ實際光量子產量(Yield)、非光化學熒光淬滅系數(qN)和光化學熒光淬滅系數(qP)、電子傳遞速率(ETR)最高，除Fv/Fm與CK差異不顯著外，均達差異顯著水平。N14處理的各指標最低，且顯著低于CK。N14＋E4處理的Fv/Fm顯著低于CK，與N14處理差異不顯著；Yield、qN、qP與CK差異不顯著，但顯著高于N14處理；ETR顯著高于CK和N14處理(P<0.05)。

表2 不同處理下桉樹葉片的葉綠素熒光參數

2.5 桉樹生理特性的相關性分析

由表3可知，Chl a＋b與Chl a極顯著正相關，與Chl b和Chl a/b顯著正相關，說明桉樹葉片的葉綠素含量主要決定于Chl a含量；Chl a＋b與SS、SP、PRO、MDA均呈負相關，且與SS相關顯著，而與除Ci外的其它光合指標和葉綠素熒光參數均呈正相關，且與Pn、Fv/Fm和ETR相關極顯著。Chl a/b與qN、qP、Fv/Fm極顯著正相關，與Pn、ETR顯著正相關，而與SS極顯著負相關，與Ci顯著負相關。

表3 桉樹生理指標間的相關系數

3 討論與結論

昆蟲體內伴生著豐富的細菌、真菌等微生物，其中細菌可為宿主昆蟲提供營養物質，合成昆蟲所必需的糖類、蛋白質以及維生素等化合物，甚至可以協助宿主入侵[13－16]。本研究用分離自桉樹枝癭姬小蜂體內的兩株優勢菌(N14、E4)培養液單獨或混合噴灑桉樹組培葉片，以期通過分析葉片中葉綠素含量、光合特性、葉綠素熒光參數和滲透調節物質含量等指標的變化，初步探究桉樹枝癭姬小蜂與桉樹的互作機制。具體研究結果如下。

葉綠素具有吸收光能的作用，其含量與光合作用緊密相關[17]。本研究發現，除Ci外，E4處理能提高桉樹組培苗葉片中的葉綠素含量和光合作用參數，而N14處理則使其降低。另外，本研究還發現N14＋E4處理的各指標值居于E4和N14處理之間，這與禹勝男等[18]的研究結論一致，表明混合細菌處理時細菌間存在一定的協同作用。

葉綠素a和葉綠素b在光合作用中發揮著不同的功能。本研究中，E4處理下葉綠素a和葉綠素b含量顯著提高，而N14對兩者尤其葉綠素a有明顯的降解作用，說明兩種優勢細菌主要通過影響葉綠素a使葉綠素總含量改變。葉綠素a/b在CK和N14＋E4處理下值相當，且高于陽生植物理論值(3.00)；在E4處理下值最高(4.27)，而在N14處理下值最低，且小于3.00，表明E4處理可大幅提高桉樹對光的捕獲能力，而N14處理則可通過降低葉綠素含量減少對光能的利用，保護光反應中心免受過剩光能的傷害[19，20]。

氣體交換參數是反映植物光合能力的表觀性狀，其中光合速率可直接反映光合作用的強弱，受氣孔因素和非氣孔因素限制。一般來說，氣孔因素限制光合速率時，Gs和Ci同時降低；而非氣孔因素限制光合速率時，Gs升高或下降，Ci升高[21]。本研究結果表明，E4處理下，Pn、Gs、Tr均升高，Ci降低，而N14和N14＋E4處理下反之，說明這兩種優勢細菌通過不同的調節方式影響植株的光合速率，其中E4主要通過增加PSⅡ潛在活性等提高光合效率，N14和混合細菌則主要通過非氣孔限制因素來降低光合速率。

葉綠素熒光是光合作用的探針，任何環境因子對光合作用的影響都可以通過葉綠素熒光動力學參數快速、靈敏且無損地反映出來[22]。本研究中，桉樹葉片的Fv/Fm、Yield、qN、qP、ETR在N14處理下均顯著降低，接近PSⅡ受損臨界值[23]，說明PSⅡ潛在活性受到明顯抑制[24]；而E4處理下Yield、qN、qP、ETR提高顯著，Fv/Fm略有提高，表現出對PSⅡ反應中心活性的明顯促進作用。表明兩種細菌在對PSⅡ光反應活性的影響上起著相反的作用，因此，兩者混合處理的效果介于單獨應用時。

PRO、SS、SP是重要的滲透調節物質，其含量增加可以提高植物細胞液的滲透壓，增強細胞的吸收保水能力，同時抑制細胞膜脂過氧化，降低膜脂過氧化產物MDA的產生，維護細胞膜穩定性，是植物抵御環境變化的重要生理調節機制[25－27]。本研究中，N14處理下桉樹葉片中的PRO、SS、SP、MDA含量顯著增加；E4處理下SS、SP、MDA含量降低，PRO含量增加；N14＋E4處理下PRO、SS、SP含量升高，MDA含量略有降低。表明不同菌處理對桉樹葉片內滲透調節物質積累的影響不同，PRO可能是桉樹應對細菌侵染的主要滲透調節物質。另外，N14處理的葉片中SS大量積累可能為桉樹枝癭姬小蜂提供營養物質，利于其近一步侵害桉樹[28，29]；而E4處理下SS下降可能是桉樹葉片發生防御反應的結果[29]。

Weidner等研究發現，單細菌和混合細菌處理對植物產生的效應往往不同，尤其是生態位互補型菌株的混合處理可以提高其對植物的正向選擇[30]。本研究結果也表明，混合菌株(N14＋E4)處理對桉樹組培苗各項生理指標的作用效果介于兩個單菌處理之間，傾向于正向作用。

綜上所述，桉樹枝癭姬小蜂體內兩種優勢細菌對桉樹組培苗葉片的生理代謝和光合熒光參數均產生了明顯影響，E4菌株以正向作用為主，N14菌株以負向作用為主，N14與E4混合處理的作用效果介于二者之間，傾向于正向作用。這可為進一步研究桉樹枝癭姬小蜂與桉樹間的侵害－防御機制及生物防治桉樹枝癭姬小蜂提供參考。