新疆玉米苗期耐旱性狀全基因組關(guān)聯(lián)分析

常曉春 李建平 郝曉燕 胡文冉 陳 果 高升旗 足木熱木·吐?tīng)栠d 趙 準(zhǔn) 黃全生 *

（1新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830091；2新疆農(nóng)作物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830091）

新疆屬于干旱半干旱地區(qū)，地下水位逐年下降，可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的水資源逐年減少。目前，影響新疆玉米生產(chǎn)最主要的問(wèn)題是干旱，新疆玉米開(kāi)花期受到干旱脅迫是導(dǎo)致玉米減產(chǎn)的主要原因。為解析玉米的耐旱性，國(guó)外科研人員從數(shù)量遺傳學(xué)角度開(kāi)展了大量工作，利用傳統(tǒng)的QTL定位和關(guān)聯(lián)分析等方法，分析玉米每株穗數(shù)、穗長(zhǎng)、單穗重、單穗粒數(shù)、百粒重等產(chǎn)量性狀以及開(kāi)花—吐絲間隔期（anthesissilking interval，ASI）、株高、穗位高、根的相關(guān)性狀等耐旱相關(guān)性狀來(lái)間接地確定玉米的耐旱性[1]。以這些性狀為基礎(chǔ)，大量的玉米耐旱性QTLs被定位。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)科研工作者在耐旱相關(guān)基因研究方面取得了很大進(jìn)展。研究人員利用來(lái)源于30個(gè)連鎖分析群體共5 000個(gè)自交系的玉米NAM群體，對(duì)干旱條件下玉米產(chǎn)量和ASI等7個(gè)性狀進(jìn)行定位，通過(guò)聯(lián)合連鎖分析檢測(cè)到169個(gè)QTLs，這些SNPs位點(diǎn)位于354個(gè)候選基因上[2-4]。

國(guó)內(nèi)外科研工作者已在玉米耐旱QTL定位和玉米耐旱相關(guān)基因發(fā)掘方面取得了一定進(jìn)展，但這些還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足目前新疆玉米生產(chǎn)實(shí)際的需要。究其原因，主要是目前玉米耐旱性QTL定位主要集中在玉米自交系上，并沒(méi)有利用生產(chǎn)上應(yīng)用的玉米雜交種（F1）進(jìn)行耐旱性QTL位點(diǎn)挖掘。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行玉米F1關(guān)聯(lián)群體的田間耐旱性鑒定與評(píng)價(jià)，開(kāi)展全基因組關(guān)聯(lián)分析，并在耐旱性優(yōu)異的回交材料中進(jìn)行前景選擇，以期獲得玉米耐旱優(yōu)異新種質(zhì)、新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為包含384個(gè)雜交種（F1）的玉米關(guān)聯(lián)群體。該群體是利用我國(guó)玉米生產(chǎn)中常用的96個(gè)自交系為母本、4個(gè)骨干自交系（鄭58、昌7-2、339M、339F）為父本，依據(jù)不完全雙列雜交（NCⅡ）設(shè)計(jì)構(gòu)建的。這些自交系分別來(lái)源于不同玉米生態(tài)區(qū)，屬于不同的雜種優(yōu)勢(shì)亞群，具有廣泛的遺傳基礎(chǔ)，是進(jìn)行耐旱關(guān)聯(lián)分析的良好材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐旱性鑒定。田間試驗(yàn)于2020年5月在新疆瑪納斯生物育種基地和新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院綜合試驗(yàn)場(chǎng)基地進(jìn)行，采用 α-lattice 設(shè)計(jì)（16×16），選地塊高低均勻、滴管分流流暢的大田，設(shè)置干旱脅迫和常規(guī)滴灌2個(gè)處理。為了嚴(yán)格進(jìn)行耐旱相關(guān)性狀鑒定，本研究中田間水分管理如下：2個(gè)處理試驗(yàn)區(qū)域均采用滴灌，常規(guī)滴灌和干旱脅迫處理播種后頭次水澆灌一致，以保證出苗；然后，常規(guī)滴灌處理每隔20 d澆水1次，直至收獲，保證玉米生長(zhǎng)正常需水；干旱脅迫處理在播種后20 d和40 d各澆水1次，玉米開(kāi)花期前后均不滴灌，至授粉完成后10 d澆1次水保證結(jié)實(shí)籽粒后期發(fā)育，屬于中度干旱脅迫。玉米生長(zhǎng)期間如遇降雨，根據(jù)雨量和持續(xù)情況判斷下次澆水與否。2個(gè)處理之間至少相隔2 m以上，防止水分相互滲透，每個(gè)處理2次重復(fù)。試驗(yàn)材料為一模兩行，行長(zhǎng)5 m，株距20 cm，種植密度大約為8.4萬(wàn)株/hm2。

試驗(yàn)期間調(diào)查形態(tài)性狀，記錄玉米出苗期、散粉期和抽絲期，于每個(gè)生長(zhǎng)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)考察小區(qū)的總株數(shù)、結(jié)實(shí)株數(shù)、株高、穗位高、雄穗長(zhǎng)度和結(jié)實(shí)株數(shù)百分率。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)：出苗期為小區(qū)內(nèi)50%的植株出苗且苗高2 cm的日期；散粉期為小區(qū)內(nèi)50%的植株雄穗散粉的日期；抽絲期為小區(qū)內(nèi)50%的果穗吐絲的日期；株高為由植株基部到頂部的高度，每行測(cè)8株；穗位高為由植株基部到主穗穗節(jié)的高度，每行測(cè)8株；雄穗長(zhǎng)度為雄穗第一節(jié)到頂部的長(zhǎng)度，每行測(cè)8株；總株數(shù)為小區(qū)內(nèi)存活的植株總數(shù)；有效株數(shù)為小區(qū)內(nèi)能正常結(jié)實(shí)的株數(shù)。

1.2.2 玉米耐旱性關(guān)聯(lián)分析。通過(guò)耐旱性鑒定試驗(yàn)，初步獲得了1年的表型數(shù)據(jù)，在384個(gè)F1群體中挑選耐旱性差異顯著的極端材料各30份，分為耐旱組與不耐旱組，然后在大田干旱條件下取材提取RNA，混池后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定差異表達(dá)基因。同時(shí)，選擇耐旱性最好的F1材料，分別用各自親本（鄭 58、昌 7-2、339M、339F）進(jìn)行回交，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定玉米耐旱性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

利用軟件Power Marker V3.25進(jìn)行遺傳多元性、多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析基因，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SAS V9.4編程進(jìn)行典型相關(guān)分析、方差分析、因子分析和表型性狀數(shù)據(jù)分析，選擇75%以上變異的性狀進(jìn)行耐旱性評(píng)價(jià)，根據(jù)群體中所有單株的基因型以及表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[5-6]。

利用全基因組SNP標(biāo)記構(gòu)建耐旱相關(guān)性狀圖譜，以玉米高密度分子標(biāo)記連鎖圖譜（Intermated B73XMo17 Map，IBM）與 IBM2 2008 Neighbors玉米連鎖圖譜為參考圖譜，產(chǎn)生的IBM neighbors高密度圖譜，比對(duì)QTL定位的原始圖譜與參考圖譜，確定玉米抗旱相關(guān)QTL的比對(duì)標(biāo)記及坐標(biāo)，發(fā)掘出與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)[7-9]。對(duì)表型數(shù)據(jù)的QTL分析可以得到控制表型的關(guān)鍵基因組區(qū)間，通過(guò)QTL定位分析雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)制選取重要關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及其基因型，控制雜種優(yōu)勢(shì)表型性狀的基因位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米耐旱性初步鑒定

在新疆大田條件下，對(duì)包含384個(gè)雜交種（F1）的玉米關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行初步的耐旱性鑒定，調(diào)查獲得了開(kāi)花—吐絲間隔期（ASI）、株高（PH）、穗長(zhǎng)（EL）等數(shù)據(jù)。結(jié)果（圖1）顯示，在干旱脅迫條件下，開(kāi)花—吐絲間隔期明顯長(zhǎng)于常規(guī)滴灌，株高和穗長(zhǎng)明顯小于常規(guī)滴灌，且都有較大的變異。說(shuō)明干旱脅迫可使玉米開(kāi)花—吐絲間隔期（ASI）變長(zhǎng)，株高變低，穗長(zhǎng)變短。方差分析表明，F(xiàn)1群體中基因型、干旱脅迫對(duì)開(kāi)花—吐絲間隔期都有極顯著影響，且基因型與干旱脅迫的交互效應(yīng)對(duì)開(kāi)花—吐絲間隔期有顯著影響；基因型和干旱脅迫對(duì)穗長(zhǎng)和株高都有極顯著影響，干旱脅迫與常規(guī)滴灌處理間玉米開(kāi)花—吐絲間隔期（ASI）、株高（PH）、穗長(zhǎng)（EL）差異均達(dá)極顯著水平。

2.2 玉米耐旱性關(guān)聯(lián)分析

分位數(shù)-分位數(shù)圖縱軸是SNP位點(diǎn)的實(shí)際-log10P值，橫軸是理論-log10P值（假設(shè)SNP與表型不相關(guān)），顯示了每個(gè)SNP位點(diǎn)P值實(shí)際值與理論值的差異。從圖2（a）曼哈頓圖可以看出，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鑒定到16個(gè)REC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，只有3號(hào)染色體上有一個(gè)很高的峰，這幾乎是最理想的GWAS結(jié)果。圖2（b）這種翹尾巴的形式是最理想的分位數(shù)-分位數(shù)圖結(jié)果，可以看到從橫坐標(biāo)大于2開(kāi)始，GWAS結(jié)果的P值與理論P(yáng)值就有了明顯的差距，說(shuō)明表型和基因型之間確實(shí)存在顯著的相關(guān)關(guān)系。曼哈頓圖本質(zhì)上是一個(gè)散點(diǎn)圖，用于顯示大量非零大范圍波動(dòng)數(shù)值，最早應(yīng)用于全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究展示高度相關(guān)位點(diǎn)，以染色體編號(hào)為橫坐標(biāo)、以SNP位點(diǎn)相關(guān)統(tǒng)計(jì)顯著性P值的-log10變換值（-log10P）為縱坐標(biāo)，其中P值為SNP位點(diǎn)相關(guān)顯著性（SNP位點(diǎn)與表型的關(guān)聯(lián)程度）。

3 結(jié)論與討論

玉米是典型的異交作物，玉米耐旱性的相關(guān)性狀、形態(tài)結(jié)構(gòu)與植株的水分吸收和散失有密切關(guān)系，形態(tài)結(jié)構(gòu)良好是玉米耐旱的機(jī)制之一[10]。玉米生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的是雜交種（F1），但在全基因組水平上直接利用F1群體進(jìn)行玉米耐旱性QTL的解析鮮有報(bào)道。因此，這方面的理論研究大大落后于實(shí)際生產(chǎn)需求。研究實(shí)例表明，利用F1進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析正在成為一種趨勢(shì)和研究方向。由于F1產(chǎn)量高、生物量大，利用F1進(jìn)行遺傳學(xué)研究，挖掘與實(shí)際田間表現(xiàn)有關(guān)的遺傳信息，能夠?yàn)樽魑锓肿佑N提供可以直接利用的遺傳和分子信息，從而更高效地推動(dòng)作物分子育種[11-14]。本研究利用96個(gè)自交系為母本、4個(gè)骨干自交系為父本，依據(jù)不完全雙列雜交（NCⅡ）設(shè)計(jì)構(gòu)建了包含384個(gè)F1的群體，開(kāi)展了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)等分析。在全基因組學(xué)水平對(duì)新疆的玉米種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)的基因型鑒定，共鑒定到16個(gè)REC關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。課題組選定開(kāi)花—吐絲間隔時(shí)間（ASI）、結(jié)實(shí)率（ESP）、產(chǎn)量（GY）和相對(duì)產(chǎn)量（RGY）等指標(biāo)進(jìn)行田間耐旱性全基因組關(guān)聯(lián)分析，整合4個(gè)指標(biāo)關(guān)聯(lián)區(qū)域，初步獲得138個(gè)與花期干旱相關(guān)的整合區(qū)域，能夠解釋34%～49%的性狀表型變異。整合區(qū)域與前面16個(gè)REC關(guān)聯(lián)區(qū)域重疊，其中4個(gè)REC關(guān)聯(lián)的單倍型可以有效地區(qū)分農(nóng)藝性狀。將為解析玉米耐旱分子機(jī)制和培育耐旱玉米新品種提供理論依據(jù)與優(yōu)異耐旱新種質(zhì)[15-18]。