紫檀芪對糖尿病性白內障大鼠氧化應激和炎癥反應的影響及機制

2022-11-17 03:04:16崔翠趙軍波王敏韓悠李佳佳

山東醫藥 2022年31期

崔翠，趙軍波，王敏，韓悠，李佳佳

邯鄲市中心醫院眼科，河北邯鄲056000

糖尿病性白內障（DC）是糖尿病患者極易出現的眼病，其典型病理特征為晶狀體上皮細胞異常遷移、增殖，導致囊膜下混濁，是引發視力障礙的首要因素。DC 的發生與高血糖觸發的氧自由基大量積聚關系密切，另外高血糖可破壞晶狀體和房水中抗氧化系統，還可引發炎癥，加劇晶狀體氧化損傷，降低血糖并減少氧自由基產生是延緩DC 進展的突破口［1-2］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可調控炎癥因子和氧自由基的釋放，參與介導糖尿病患者體內炎癥和氧化應激反應。激活AMPK 信號，促進沉默信息調節因子1（SIRT1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1α（PGC-1α）表達，降低血糖，減少促炎細胞因子IL-8 和活性氧的產生，抵抗腸道過氧化和炎癥損傷［3］。糖尿病患者晶狀體上皮細胞中AMPK 的磷酸化顯著減弱，且抗氧化酶活性降低、晶狀體上皮細胞發生遷移，其與DC 形成有關［4］，因而激活AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路可能具有防治DC的潛力。紫檀芪是天然二苯乙烯類產物，具有抗氧化、抗炎與調節糖脂代謝的作用，可升高SIRT1蛋白表達，減輕糖尿病小鼠腎臟炎癥［5］，抑制氧化應激引起的關節軟骨細胞凋亡［6］。但紫檀芪是否通過調節AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路減輕DC 大鼠氧化應激反應，進而延緩DC 進展，目前尚無明確闡述。2021 年10 月—2022 年1 月，本研究以紫檀芪干預DC 大鼠，探討其對大鼠氧化應激和炎癥反應的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SD 雄性大鼠76 只，SPF級，由北京唯尚立德生物科技有限公司提供，體質量264～280 g，10 周齡，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0010。所有大鼠在本院獨立動物房中適應性飼養，室溫和濕度分別設為23～25 ℃、55%～65%，每天保持通風換氣8～10 h，明暗各12 h循環光照，適應性飼養1 周后進行實驗。本研究經醫院倫理委員會批準，批準號：倫審-2021-093。紫檀芪標準品（純度≥98%，批號SP9570）、AMPK 抑制劑（Dorsomorphin）（純度≥98%，批號IB0330）、鏈脲佐菌素標準品（純度：HPLC≥98%，批號SS9500）均購自北京索萊寶科技有限公司；高強度RIPA 裂解液（批號W062-1-1）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號D006-1-4）、丙二醛（MDA，批號A003-1-2）、超氧化物歧化酶（SOD，批號A001-3-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx，批號A005-1-2）、IL-6（批號H007-1-2）、IL-17（批號H014-1）、IL-10（批號H009-1）檢測試劑盒、BCA總蛋白定量測定試劑盒（批號A045-4-2）均購自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源抗大鼠波形蛋白（Vimentin）一抗（批號AF1975）、N-鈣黏蛋白（Ncadherin）一抗（批號AF5237）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）一抗（批號AF6759）、AMPK 一抗（批號AF6195）、磷酸化AMPK（p-AMPK）一抗（批號AF5908）、SIRT1 一抗（批號AF5300）、PGC-1α 一抗（批號AF7736）、山羊抗兔二抗（批號A0208）均購自上海碧云天生物技術有限公司；兔源抗大鼠GAPDH一抗（批號ab181602）購自美國Abcam 公司。手持裂隙燈（型號KJ5S3）購自蘇州康捷醫療股份有限公司；血糖儀（型號One Touch Ⅱ）購自美國強生公司；倒置雙目生物顯微鏡（型號LW200ET-A）購自上海尖端光電科技有限公司；組織脫水機（型號MTP）、石蠟切片機（型號CUT4062）均購自德國SLEE公司；酶標儀（型號680）、基礎電泳儀（型號PowerPacTM）、化學發光成像系統（型號ChemiDoc MP）均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 DC 模型構建及藥物干預取64 只大鼠制備DC 模型，方法參照文獻［7］：以檸檬酸緩沖液溶解配制質量分數為1%鏈脲佐菌素溶液，以60 mg/kg 的劑量腹腔內注射，72 h 后通過尾靜脈取血測量大鼠空腹血糖，取血糖≥16.7 mmol/L 的糖尿病大鼠繼續飼養，6 周后采用裂隙燈觀察大鼠晶狀體，當出現空泡并有乳白色絮狀混濁時表示DC 模型構建成功。共60 只造模成功，將其隨機分為模型組及紫檀芪低劑量組、紫檀芪中劑量組、紫檀芪高劑量組［8］、紫檀芪高劑量+Dorsomorphin組各12只，另取12只正常大鼠作為對照組。將紫檀芪和Dorsomorphin 溶于0.9%氯化鈉溶液中，分別配制濃度為2、4、8 mg/mL 紫檀芪溶液及0.02 mg/mL Dorsomorphin 溶液。紫檀芪低、中、高劑量組分別給予2、4、8 mg/mL紫檀芪溶液灌胃（10 mL/kg），同時給予0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射（10 mL/kg）；紫檀芪高劑量+Dorsomorphin 組給予8 mg/mL 紫檀芪溶液灌胃（10 mL/kg），同時給予0.02 mg/mL Dorsomorphin 溶液尾靜脈注射（10 mL/kg）［8-9］；模型組、對照組均給予0.9%氯化鈉溶液灌胃（10 mL/kg），同時給予0.9%氯化鈉溶液尾靜脈注射（10 mL/kg）。各組大鼠均每天按上述方式給予藥物干預1次，共干預14 d。

1.3 大鼠空腹血糖檢測及晶狀體混濁情況評價第14天給藥干預后24 h，采集大鼠尾靜脈血，使用血糖儀測量大鼠空腹血糖。然后手持裂隙燈觀察各組大鼠晶狀體混濁情況，遵照以下標準評分［10］：晶狀體清透明亮，無混濁，計1分；晶狀體周圍出現少量空泡，發生輕度混濁，計2分；晶狀體周圍空泡擴散至中心區，核區出現霧狀混濁，發生中度混濁，計3分；晶狀體周圍空泡擴散至核區，核區霧狀混濁加重，發生高度混濁，計4 分；晶狀體核區混濁，形成完全性白內障，計5分。

1.4 大鼠晶狀體標本采集及其組織結構變化觀察以上檢測結束后，用乙醚氣體麻醉大鼠，采集其尾靜脈血并在4 ℃下1 500 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），吸出上清液于-80 ℃保存。脫頸快速殺死大鼠，摘下眼球剝離出雙側晶狀體，左側晶狀體稱質量后剪碎加入適量高強度RIPA裂解液，冰上充分研磨成漿，在4 ℃下3 000 r/min離心20 min，吸出上清液于-80 ℃保存；右側晶狀體漂洗后浸入4%多聚甲醛溶液中充分固定，運用組織脫水機、基礎性石蠟包埋系統、石蠟切片機進行脫水包埋后切片，將所得約5 μm厚的晶狀體組織切片脫蠟，以梯度乙醇溶液水化后采用HE染色，最后封片觀察晶狀體組織結構變化。

1.5 大鼠晶狀體組織中氧化應激指標（MDA、SOD、GSH-Px）及血清炎癥指標（IL-6、IL-17、IL-10）檢測于4 ℃冰箱中解凍采集的大鼠血清及晶狀體組織樣品液，各取出0.4 mL，使用比色法測定晶狀體組織中MDA、SOD、GSH-Px，采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清IL-6、IL-17、IL-10，具體步驟嚴格按照各自試劑盒操作說明書進行。

1.6 大鼠晶狀體組織中上皮間質轉化標志蛋白（Vimentin、N-cadherin、E-cadherin）及AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路蛋白表達檢測取以上檢測剩余的晶狀體組織樣品液，采用BCA 總蛋白定量測定試劑盒測出各組蛋白總濃度，取20 μg 蛋白，以適量上樣緩沖液混勻后加熱變性，電泳（110 V，90 min）后電轉（40 mA，70 min），使蛋白按分子量大小分離開后移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，添加Vimentin（1∶300）、N-cadherin（1∶300）、E-cadherin（1∶300）、AMPK（1∶400）、p-AMPK（1：400）、SIRT1（1∶200）、PGC-1α（1∶200）、GAPDH（1∶500）一抗孵育過夜，再加入山羊抗兔二抗（1∶2 000）37 ℃孵育1.5 h，用TBST 溶液清洗3 次，使用化學發光液顯色后拍攝圖像，用Image J 軟件分析圖像中各蛋白灰度值。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.7 統計學方法采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紫檀芪對大鼠空腹血糖和晶狀體混濁的影響見表1。

表1 各組空腹血糖和晶狀體混濁評分比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與紫檀芪低劑量組比較，cP＜0.05；與紫檀芪中劑量組比較，dP＜0.05；與紫檀芪高劑量組比較，eP＜0.05。

2.2 紫檀芪對大鼠晶狀體組織結構的影響對照組大鼠晶狀體上皮細胞形態規則，均勻整齊分布于晶狀體前囊和赤道部；模型組大鼠晶狀體上皮細胞呈片狀、條索狀向晶狀體成纖維細胞遷移聚集；紫檀芪低、中、高劑量組大鼠晶狀體上皮細胞上述形態改變及遷移聚集現象得到改善，且隨紫檀芪劑量升高而改善程度增強；紫檀芪高劑量+Dorsomorphin 組大鼠晶狀體上皮細胞上述形態改變及遷移聚集現象相比紫檀芪高劑量組加重。見圖1。

圖1 各組大鼠晶狀體組織結構變化（HE染色×200）

2.3 紫檀芪對大鼠晶狀體組織中氧化應激指標水平的影響見表2。

表2 各組晶狀體組織中氧化應激指標水平比較（）

2.4 紫檀芪對大鼠血清炎癥指標水平的影響見表3。

表3 各組血清炎癥指標水平比較（pg/mL，）

2.5 紫檀芪對大鼠晶狀體組織中上皮間質轉化標志蛋白表達的影響見表4。

表4 各組晶狀體組織中上皮間質轉化標志蛋白表達比較（）

2.6 紫檀芪對大鼠晶狀體組織中AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路蛋白表達的影響見表5。

表5 各組晶狀體組織中p-AMPK/AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達比較（）

3 討論

預防和控制DC 發生及進展是目前臨床面臨的嚴峻挑戰。手術是DC 最主要的治療手段，但存在出血、感染、視網膜病變等風險，因此探尋有效藥物控制血糖、延緩白內障進展意義重大［11］。本研究向大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素構建DC 模型，結果顯示，鏈脲佐菌素可顯著升高大鼠空腹血糖，促使炎癥因子IL-6 與IL-17 大量生成，減少抗炎因子IL-10 產生，損害大鼠晶狀體組織抗氧化功能，導致其脂質過氧化產物MDA 大量形成，增強晶狀體上皮細胞上皮間質轉化，引發其呈片狀、條索狀向晶狀體成纖維細胞遷移聚集，導致晶狀體混濁，最終引起DC 發生發展，模型建立成功。

DC 發病機制復雜，氧自由基產生、降解失衡導致的應激反應和氧化損傷是其主要致病原因。糖尿病患者的高血糖不僅誘導氧自由基和促炎因子過量生成，還損害機體抗氧化和抗炎功能，導致并加重晶狀體炎癥和氧化損傷，引起晶狀體渾濁，拮抗炎癥和氧化應激反應是防治DC 的主要病理學基礎［12］。紫檀芪是能降脂、抑炎抗菌及抗氧化的天然化合物，能通過上調SIRT1表達而減輕糖尿病小鼠腎臟炎癥損傷［5］，并通過阻止氧化應激抑制關節軟骨細胞凋亡［6］，還可通過促進SIRT1 表達而減輕高糖缺氧復氧引起的腎近曲小管細胞損傷［13］。本研究以不同劑量紫檀芪干預DC 模型大鼠，可降低其空腹血糖、晶狀體混濁情況評分、血清IL-6 與IL-17 水平、晶狀體組織中MDA 與Vimentin、N-cadherin 蛋白表達水平，升高晶狀體組織中SOD 與GSH-Px 水平、血清IL-10水平、晶狀體組織中E-cadherin 蛋白表達水平，改善大鼠晶狀體上皮細胞片狀、條索狀形態改變及遷移聚集現象。表明紫檀芪可降低促炎因子表達，增強抗炎因子表達和抗氧化酶活性，減弱DC 大鼠體內炎癥和氧化應激，緩解晶狀體上皮細胞片狀、條索狀形態改變及遷移聚集，改善晶狀體混濁癥狀，延緩DC進展，并隨劑量升高而作用增強。

AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號通路通過調控炎癥和氧化應激在細胞凋亡、衰老及線粒體功能維持中起著關鍵作用。激活該信號，可減少炎癥介質、活性氧和脂質過氧化產物生成，消除神經炎癥和氧化應激，改善乳酸脫氫酶-B 敲除小鼠神經退行性病變［14］，并可通過抗氧化及抗炎作用改善衰老相關的腎功能損傷［15］；另外通過激活AMPK 可減輕氧化應激誘導的人晶狀體上皮細胞衰老，緩解年齡相關性白內障形成和發展［16］。本研究結果顯示，DC大鼠晶狀體組織中p-AMPK/AMPK 及SIRT1、PGC-1α 蛋白表達水平顯著降低，以紫檀芪干預DC 大鼠，可升高其晶狀體組織中AMPK 磷酸化及SIRT1、PGC-1α 蛋白表達，表明AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號參與介導紫檀芪對DC 大鼠的治療過程。以高劑量紫檀芪干預DC 大鼠的同時，采用AMPK 抑制劑Dorsomorphin抑制AMPK/SIRT1/PGC-1α 信號激活可減弱紫檀芪的抗炎及抗氧化活性，抵抗其對DC 大鼠晶狀體上皮細胞形態改變及遷移聚集現象的改善，最終逆轉紫檀芪對大鼠晶狀體混濁等白內障癥狀的緩解作用。揭示紫檀芪是通過激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路減輕DC 大鼠氧化應激反應，延緩其白內障進展的。

綜上所述，紫檀芪可顯著減少DC 大鼠體內氧自由基及炎性介質生成，消除晶狀體炎癥和過氧化反應，減輕晶狀體上皮細胞的片狀、條索狀形態改變，改善其向晶狀體成纖維細胞遷移聚集及晶狀體混濁，延緩白內障進展，促進AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路激活傳導是其作用機制之一。本研究為DC的臨床治療帶來了新的候選藥物，有益于糖尿病眼部并發癥的防治。