調節性細胞壞死在肺纖維化中的作用研究進展

羅干，倪吉祥，徐彪，談華棟

三峽大學人民醫院 宜昌市第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科，湖北宜昌443000

肺纖維化是一種進行性發展且致命的疾病，受遺傳、環境、衰老表觀遺傳變化相互作用影響，導致肺泡上皮細胞（AEC）損傷，從而引發AEC 異?；罨；罨纳掀ぜ毎置诖罅考毎蜃樱甾D化生長因子β（TGF-β），從而促進成纖維細胞遷移和增殖，并使成纖維細胞分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞分泌大量細胞膠原蛋白，從而導致膠原蛋白進一步沉積。在損傷修復階段，激活細胞凋亡途徑和巨噬細胞的吞噬作用，可恢復內環境的穩態。在肺纖維化中存在一種嚴密調控的非凋亡性但具有壞死形態特征的新細胞死亡方式，此過程被稱為調節性細胞壞死。調節性細胞壞死包括細胞程序性壞死、細胞焦亡、細胞鐵死亡等?，F將幾種常見的調節性壞死方式涉及的信號通路及其在肺纖維化中的作用機制綜述如下。

1 細胞程序性壞死與肺纖維化的關系

1.1 細胞程序性壞死 細胞程序性壞死是一種受死亡受體以及Toll樣受體的配體和某些病原體調控的促炎癥性反應，但不依賴半胱氨酸天冬氨酸壞死細胞的死亡形式。這種細胞死亡過程依賴于受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸激酶1（RIPK1），并且可被程序性壞死抑制素-1（nec-1）抑制［1］。隨著研究深入，程序性壞死被定義為由RIPK1、絲氨酸/蘇氨酸激酶3（RIPK3）、混合譜系激酶結構域樣蛋白（MLKL）三者相互介導，如在小鼠巨細胞病毒感染、一氧化氮誘導的胰腺β細胞死亡和成纖維細胞死亡中發現混合譜系激酶結構域樣假激酶（MLKL）作為細胞程序性壞死的效應器，進一步增強了這一效應表達［2-3］。最具有特征性的程序性壞死形式由腫瘤壞死因子α（TNF-α）引發，也可由TNF-α死亡配體家族的其他成員引發，如死亡因子配體和TNF 相關凋亡誘導配體以及干擾素、Toll 受體信號和通過Z 型DNA 結合蛋白1 的病毒感染誘導［4］。在典型的壞死途徑中，TNF-α 與其受體腫瘤壞死因子1 型受體（TNFR1）結合并將其激活，促進TNF 受體相關死亡域結合蛋白的募集（TRADD）。TRADD 通過其細胞內DD 結構域與TNFR1 的細胞內死亡結構域結合，并招募TNF 受體相關因子蛋白、細胞凋亡抑制劑蛋白、線性泛素組裝復合物、RIPK1、血紅素氧化IRP2泛素連接酶1L（HOIL-1L）、HOIL-1L 相互作用蛋白，共同形成TNFR復合物Ⅰ并誘導核因子-κB（NF-κB）信號傳導［5］。圓柱瘤蛋白是一種導致TNFR 復合物Ⅰ失去穩態的去泛素化酶，可導致TNFR復合物Ⅰ與胞漿中的受體分離，并通過形成兩種類型的TNFR復合物Ⅱ促進細胞死亡。雖然信號傳導在凋亡和程序性壞死之間相互作用，但最終信號傳導依賴于半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶8（Caspase-8）。當TNFR復合物Ⅱa形成時，死亡因子相關死亡域和Caspase-8被組裝以誘導細胞發生凋亡。相反，當TNFR 復合物Ⅱa 中的Caspase-8 激活受損時，TNFR 復合物Ⅱb（即壞死小體）形成，RIPK1 通過RIPK3 募集和激活啟動程序性壞死［6］。參與RIPK3 激活的信號通路涉及RIP 同型相互作用基序（RHIM）域的受體、適配器和激酶的同型相互作用。RIPK1 和RIPK3 的RHIM結構域啟動細胞程序性壞死，介導壞死小體的淀粉樣信號復合物形成，這一過程由熱休克蛋90 和細胞分裂周期37輔助完成［7］。一旦壞死小體形成，RIPK3磷酸化，導致MLKL自身磷酸化寡聚并轉移到細胞膜上，形成質膜孔，使細胞破裂及細胞膜通透性增強，細胞內物質釋放，形成損傷相關分子模式（DAMP），經典DAMP包括熱休克蛋白（HSP）、促進炎癥的高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、S100蛋白家族［5，8］。

1.2 細胞程序性壞死在肺纖維化中的作用 肺纖維化的病理特征為AEC 損傷，導致傷口愈合失調，促炎性應激反應，從而導致肌成纖維細胞分化和肺間質中異常的膠原沉積。過去認為上皮細胞凋亡是肺纖維化發病機制中調節性壞死的主要形式。然而有關研究在TUNEL分析中檢測到肺泡上皮細胞存在非凋亡DNA片段，表明TUNEL陽性細胞不僅包括凋亡細胞，還包括壞死細胞。損傷后的上皮細胞向細胞外空間釋放趨化因子和DAMP、熱休克蛋白和白細胞介素［9］。DAMP 可以激活鄰近上皮細胞和免疫細胞上的模式識別受體，直接刺激促纖維化細胞因子釋放，進而參與成纖維細胞激活。上皮細胞還分泌促炎性細胞因子，這些細胞因子相互聚集并激活適應性免疫細胞（T淋巴細胞、B淋巴細胞），進一步分泌促纖維化因子（IL-33、IL-4、IL-5、IL-13）。據報道，體外受損上皮細胞釋放的HMGB1 導致IL-1β 水平上調，進而激活TGF-β1，促進AEC間質轉化［10］。LI等［11］證明HMGB1可以通過激活TGF-β1/Smad2信號通路介導氣道上皮細胞的上皮間質轉化（EMT）。WANG等［12］隨后證明，HMGB1誘導的TGF-β1釋放先于肺成纖維細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白（COL1）表達上調?？傊?，以上研究表明，受損上皮細胞釋放的HMGB1可能通過持續上調TGF-β1，導致成纖維細胞活化、分化和膠原蛋白沉積，從而促進纖維化的發展。尤其是在AEC 中，觀察到RIPK3 和磷酸化的MLKL 在內的壞死性標志物表達顯著高于健康對照組［13］。同樣觀察到，在博來霉素（BLM）誘導小鼠的AEC 中RIPK3、磷酸化的MLKL 表達上調，并釋放HMGB1 和IL-1β；且在RIPK3 基因敲除小鼠模型中得以證實，在BLM 誘導下，細胞炎癥化和纖維化的表達均減弱［11，13］。這表明細胞程序性壞死有助于纖維化的發展，且能被nec-1有效抑制。表明細胞程序性壞死釋放的DAMP通過調節炎癥和肌成纖維細胞的積聚，對肺纖維化的發病機制進行調控。

2 細胞焦亡與肺纖維化的關系

2.1 細胞焦亡 細胞焦亡是調節性細胞壞死一種新的途徑，一種不同于細胞凋亡的死亡方式，發生在實質及非實質細胞間，涉及細胞腫脹破裂、滲透溶解和細胞內容物（IL-1β、IL-18、HMGB1）的釋放，且伴有細胞器變形、DNA 斷裂和核濃縮，從而導致炎癥反應［14］。細胞焦亡最初被認為只是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）介導的細胞死亡。隨著研究的深入，發現Caspase-3、4、5、8 和11 也能介導細胞焦亡［15］。經典的細胞焦亡信號調節，通過模式識別受體和炎癥小體蛋白復合物介導微生物產物激活Caspase-1。最具廣泛特征性炎癥小體家族是NLRP3 炎癥小體的NOD 樣受體結構域，由NLRP3、NLR 家族的細胞溶質傳感器、銜接分子凋亡相關斑點樣蛋白和激活的Caspase-1 組成。炎癥小體的組裝始于細胞溶質模式識別受體（包括炎癥小體傳感器），能夠識別DAMP 和危險相關分子模式，后者是細胞應激的次級產物［16］。炎癥小體的激活需要兩步激活和啟動信號。啟動信號由TLR 配體或干擾素信號介導，并通過活化NF-κB 誘導某些炎癥小體成分的轉錄。炎癥小體組裝后，Caspase-1 被激活，并水解成2 個片段，形成一個二聚體。一方面，Caspase-1在Asp275位點切割堿性執行蛋白GSDMD，形成C 末端（GSDMD-C）和N 末端（GSDMD-N）。GSDMD-N 能穿透細胞膜，形成內徑10～14 nm 的非選擇性孔，導致細胞腫脹［17］。另一方面，Caspase-1 分解促炎細胞因子IL-1β、IL-18 的前體，這些前體通過GSDMD 形成的孔釋放來增加細胞膜通透性，包括IL-1β、IL-18 在內的細胞質內容物滲出，進一步觸發細胞焦亡［18］。非經典途徑由Caspase-4、-5、-11介導，其中Caspase-4、-5 存在于人類中，Caspase-11 存在于小鼠中。該途徑由脂多糖（LPS）直接激活，激活后的Caspase-4、-5、-11誘導細胞溶質蛋白GSDMD分裂為GSDMD-N 和GSDMD-C。N 末端片段在細胞膜內寡聚形成熱解孔，導致細胞的通透性屏障破壞，K+外流，誘導NLRP3 炎性小體組裝，最終導致細胞焦亡［19］。但研究發現，細胞膜半通道蛋白（Pannexin-1）是另一個關鍵蛋白，在Caspase-11 誘導的非經典途徑中介導細胞焦亡。在LPS 刺激下，激活的Caspase-11 可以特異性剪切和修飾Pannexin-1，導致細胞釋放ATP，從而誘導通過離子通道P2X7受體介導的細胞死亡［20］。

2.2 細胞焦亡在肺纖維化中的作用 有研究表明，在矽肺、肺纖維化引起的肺損傷中，Caspase-1、NLRP3、IL-1β、IL-18 和GSDM 家族蛋白都與患者的纖維化發展呈正相關［21］。TGF-β是一種主要的促纖維化細胞因子，Caspase-1、NLRP3 和NF-κB 已被確定為TGF-β/SMAD 軸的重要上游激活劑［22］。由于細胞焦亡是纖維化的關鍵部分，因此對抗細胞焦亡可以作為抗纖維化治療的新靶點。HUSSAIN 等［23］將原代人支氣管上皮樣細胞（HBE 細胞）充分暴露于多壁碳納米管中，后將人胚肺成纖維細胞（MRC-5）以多壁碳納米管時間-劑量方式培養于HBE 細胞稀釋后的培養基中。經過一段時間處理后，促纖維化標志物的mRNA 表達顯著增加，但TGF-β 表達并無變化。但當條件培養基中添加IL-1β、IL-11 中和抗體或使用NLRP3 小干擾RNA 轉染HBE 細胞的條件培養基后，促纖維化標志物表達顯著降低。這說明上皮細胞中NLRP3 炎性小體激活是MRC-5 細胞促纖維化基因表達的關鍵介質。另外，LIANG 等［24］通過觀察石蒜堿（LYC）對BLM 誘導的肺纖維化小鼠模型和NLRP3炎癥小體激活，發現LYC在BLM誘導的小鼠急性肺損傷期間能抑制活性Caspase-1 表達和乳酸脫氫酶釋放。并且體外試驗表明，LYC 抑制LPS/ATP 誘導的NLRP3 炎癥小體激活及骨髓源性巨噬細胞焦亡。LYC 可通過靶向pyrin 結構域（PYD）來干擾NLRP3與凋亡相關微粒蛋白（ASC）的相互作用。結果表明，LYC 的保護作用依賴于通過靶向ASC 的PYD 結構域來抑制NLRP3 炎癥小體激活和細胞焦亡，從而改善BLM 誘導的肺纖維化。LI等［25］研究表明，二氧化硅持續激活NLRP3 炎癥小體，并且IL-1β 和IL-18 的細胞外表達水平持續升高。并通過短發夾RNA介導NLRP3表達下調，抑制了細胞焦亡。使用NLRP3選擇性抑制劑MCC950和Caspase-1 抑制劑Z-YVAD-FMK 能降低二氧化硅誘導的炎癥細胞數量及α-SMA 的表達。并通過分析表明，TKA1-MAPK/NF-κB 通路參與了NLRP3 炎癥小體介導的EMT。上述研究表明，通過下調NLRP3表達，抑制NLRP3 炎癥小體本身的激活及其效應物均可以緩解二氧化硅誘導的EMT。提示NLRP3 炎癥小體通過IL-1β-TAK1 MAPK/NF-κB 途徑調節二氧化硅誘導的EMT，從而誘導肺纖維化。因此，細胞焦亡是一種以炎癥為特征的免疫調節反應，調節肌成纖維細胞的激活，導致細胞外基質及膠原蛋白沉積，從而導致肺纖維化。NLRP3 炎癥小體參與了肺纖維化發展過程，干預NLRP3 炎癥小體可改善肺纖維化發展，所以NLRP3 炎癥小體未來有可能成為肺纖維化治療的新靶點。

3 細胞鐵死亡與肺纖維化的關系

3.1 細胞鐵死亡 DIXON 等［26］首次將細胞鐵死亡描述為一種新的調節性細胞壞死，細胞鐵死亡的激活受脂質修復酶的潛在調節，脂質修復酶包括谷胱甘肽（GSH）和GSH 過氧化物酶4（GPX4）。細胞鐵死亡由鐵依賴性活性氧（ROS）和脂質過氧化物的過度聚集引起，其特征是線粒體膜密度增加和細胞體積縮小，線粒體嵴在形態學上不同于凋亡和壞死［27］。胱氨酸-谷氨酸反向轉運體（System Xc-）調控途徑系統，由催化亞單位溶質載體家族7 成員11（SLC7A11）和調節亞單位溶質載體家族3 成員2（SLC3A2）組成，該轉運體是一種促進胱氨酸進入細胞的胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白，在調節細胞鐵死亡中起重要作用。System Xc-介導細胞內胱氨酸和細胞外谷氨酸的交換，比例為1∶1。細胞內的胱氨酸可以轉化為半胱氨酸，半胱氨酸是合成GSH 的限速底物。GSH 對細胞抗氧化防御系統很重要，可以直接與ROS/氮物種、親電體相互作用，也可以作為各種抗氧化酶的輔助因子［27-28］。研究表明，GSH 在控制細胞鐵死亡中所起的關鍵作用歸因于GPX4 輔助因子的功能。GPX4 通過抑制細胞膜的過氧化作用保護細胞免受鐵死亡的影響。細胞內游離鐵和脂質過氧化物的存在都是執行細胞鐵死亡的先決條件［28］。雖然通過β-巰基乙醇增加胱氨酸攝取和通過靶向激活轉錄因子4促進SLC7A11基因轉錄可以抑制細胞鐵死亡，但通過其抑制劑（包括erastin、柳氮磺胺吡啶、谷氨酸）阻斷System Xc-可導致胱氨酸吸收不足，GSH 消耗，抗氧化能力降低、脂質ROS 積累，從而誘導細胞鐵死亡［29］。除了關鍵的細胞鐵死亡調節途徑外，多個小分子蛋白53、核因子紅細胞樣蛋白2 相關因子2（Nrf2）和絲裂原活化蛋白激酶均參與了細胞鐵死亡的調節。

3.2 細胞鐵死亡在肺纖維化中的作用 研究表明，肺纖維化患者肺中的總鐵水平、鐵相關氧自由基和含鐵巨噬細胞較正常組均有所增加［30］。鐵死亡是一種與炎癥病理學有關的程序性細胞死亡。有研究發現，ROS 聚集增加和GSH 消耗與細胞鐵死亡過程密切相關，在肺纖維化的發病機制中也起著關鍵作用［31］。放射性肺纖維化（RILF）是胸部放射治療中一種嚴重的危及生命的并發癥。LI 等［32］發現鐵死亡促進RILF的發生發展，并且闡明ROS聚集是這一過程中細胞鐵死亡的關鍵誘因。在RILF 小鼠模型照射組中發現，肺組織體積縮小，線粒體密度增加，嵴減少，外膜中斷，這些均呈現典型的鐵死亡特征，且ROS 水平上調，GPX4 水平下調。鐵死亡抑制劑liproxstatin-1（Lip-1）可使RILI 小鼠肺結構損傷減輕，出血減少，線粒體收縮減少，GPX4 水平增加，膠原蛋白沉積被抑制，下調了RILF 小鼠肺內ROS 和HYP 的水平，降低了血清炎性細胞因子水平。但是RILF 小鼠中的Nrf2、血紅素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）蛋白、mRNA 表達均被Lip-1 上調。因此，Lip-1 通過激活Nrf2、上調HO-1 和NQO1表達、下調TGF-β1表達、抑制肺組織細胞鐵死亡來減弱RILF。另外，鐵死亡與百草枯（PQ）誘導的肺損傷有關，鐵死亡抑制劑有望治療PQ中毒。在肺纖維化氧化藥物和細胞壽命模型中，鐵死亡激活劑erastin 降低人胎肺成纖維細胞中GPX4 的活性，并促進脂質過氧化物、α-SMA、COL1的表達，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化［33］。鐵死亡抑制劑Fer-1增加GPX4 表達并降低脂質過氧化物，消除TGF-β1和erastin 對細胞鐵死亡的影響，抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，延緩IPF 進程［34］。WANG等［35］研究證明，PM2.5 誘導內皮細胞會破壞細胞內鐵和氧化還原平衡，進而導致內皮細胞鐵死亡，并分泌炎性細胞因子。并且由鐵依賴性脂質過氧化引起的PM2.5 誘導的鐵死亡，可在藥理學上通過脂質氧化抑制劑和鐵螯合劑進行挽救。

綜上所述，隨著對調節性細胞壞死的進一步了解，細胞程序性壞死、細胞焦亡、細胞鐵死亡區別于之前所研究的細胞凋亡及細胞壞死。通過多種細胞死亡途徑來提高了對肺纖維化機制的認知。調節性細胞壞死的發生受某些免疫過程的影響，這些免疫過程中出現的調節網路可能對肺部疾病的治療至關重要。在未來的工作中，需要深入研究肺纖維化中調節性細胞壞死通路之間的相互聯系，取得肺部疾病臨床治療的歷史性突破。