NLRP3炎癥小體在蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究進展

姜銅源，冀兵

1 山西醫科大學第一臨床醫學院，太原 030000；2 山西醫科大學第一醫院急診醫學中心

蛛網膜下腔出血（SAH）是臨床常見神經系統疾病，具有高死亡率及高致殘率，幸存者也極有可能出現長期神經功能缺陷［1］。SAH 的不良預后與早期腦損傷（EBI）、腦水腫和遲發性腦血管痙攣相關。EBI是SAH 后72 h 內整個腦組織的直接損傷，目前被認為是SAH 患者死亡和遲發性神經功能缺損的主要原因之一［2］。造成EBI 可能的機制包括神經炎癥反應、顱內壓升高、腦血流減少、微血栓的形成、血腦屏障破壞（BBB）和腦水腫［3-4］。以促炎介質的釋放以及小膠質細胞和星形膠質細胞激活為特征的神經炎癥反應，加劇了SAH 后的EBI。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體參與SAH 后神經炎癥，在SAH 后24 h內NLRP3炎癥小體表達水平上調并達高峰，同時炎癥因子及IL-1β、IL-18水平升高［1-2］。應用NLRP3 炎癥小體抑制劑可提高前循環自體血注射SAH 模型小鼠的生存率，改善其EBI 和神經功能缺損。這可能與NLRP3 炎癥小體在SAH后具有強大的抗炎作用有關，在減輕水腫、保護緊密連接、改善微血栓形成、延遲腦血管痙攣和改善功能缺陷中發揮重要作用［5］。本文對NLRP3炎癥小體在SAH中的作用進行綜述。

1 NLRP3炎癥小體

NLRP3 炎癥小體是一種由NLRP3 蛋白、銜接蛋白（ACS）、半胱氨酸天冬氨酸酶-1 前體（pro-caspase-1）三部分組成的多蛋白聚合復合物。NLRP3 蛋白包含三部分：C 端的亮氨酸重復序列（LRR）、中段特征性的核苷酸寡聚化結構域和N 端的效應結構域（PYD）三部分；ASC蛋白包含1個PYD結構域和1個半胱天冬酶激活和募集結構域（CARD）；pro-caspase-1 也包含一個CARD 結構域［6］。NLRP3 蛋白可以與ACS 的PYD 結構域相結合，結合后的復合物通過ACS 的CARD 與pro-caspase-1 的CARD 相互結 合實現對pro-caspase-1 的募集，部分組裝的ACS 結構域將效應蛋白pro-caspase-1 剪切為caspase-1，形成具有活性的NLRP3 炎癥小體，caspase-1 可以剪切前IL-1β（pro-IL-1β）、前IL-18（pro-IL-18）、細胞焦亡效應蛋白（GSDMD），促進IL-1β、IL-18、活化型GSDMD（GSDMD-p30）的形成［6］。研究發現，有絲分裂基因A 相關表達的激酶7（NEK7）也是NLRP3 炎癥小體的組成部分，可以在啟動和激活間期與NLRP3 蛋白的LRR及NACHT結合［7］。在靜息狀態下，NLRP3蛋白的基礎水平較低，不會與銜接蛋白ACS、效應蛋白前體pro-caspase-1進行［8］。

2 NLPR3炎癥小體的激活

活性NLRP3 炎性小體的功能調節過程分為兩步。首先需要非激活的“啟動”刺激來啟動關鍵炎癥小體成分的表達，然后是炎癥小體組裝的第二信號“激活”刺激。啟動由TLR/核因子-κ 輕鏈增強子（NF-κB）途徑或活性氧自由基（ROS）通路誘導，使NLRP3 蛋白、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNA 表達上調。第二信號由K+外流、Ca2+內流、ROS 的形成、溶酶體破裂介導，激活NLRP3 蛋白，并與ASC 和caspase-1在級聯反應中結合，形成具有活性的NLRP3 炎癥小體。

Toll 樣受體4（TLR4）可識別SAH 后損傷相關分子模式、腫瘤壞死因子等信號，隨后通過激活NF-κB使NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18 mRNA 表達上調［9］。NF-κB 通路使NLRP3 炎癥小體啟動的機制可能由p65核轉位介導，增加了NLRP3蛋白的基因轉錄，這有助于NLRP3炎癥小體的形成［10］。

ROS 通路的關鍵步驟是ROS 的產生，其中線粒體功能障礙來源的ROS 是最早被認為激活炎癥小體的主要因素之一。受體相互作用蛋白（RIP）是一個絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，由四種異構體RIP1-4 組成。研究指出RIP1 和RIP3 的活性形式可以構成RIP1-RIP3 復合物，該復合物參與NLRP3 炎癥小體的激活。在SAH 后腫瘤壞死因子刺激RIP1-RIP3 復合物的形成。線粒體功能障礙由動力相關蛋白1（DRP1）調節，DRP1 介導線粒體有絲分裂，促進內質網應激，增加ROS 的生成［11］。SAH 的發生會導 致RIP1、RIP3、磷酸化DRP1 和NLRP3 蛋 白、pro-IL-1β、ROS 類物質表達上調，且SAH 后NLRP3炎癥小體激活可能是由RIP1-RIP3-DRP1-ROS 通路介導。同時向SAH 小鼠腹腔注射PIP1 激酶抑制劑（Nec-1）或線粒體分裂抑制劑（Mdivi-1），發現Nec-1降低了小鼠腦組織中的RIP1、RIP3、磷酸化DRP1和NLRP3 炎癥小體表達；Mdivi-1 可抑制DRP1 蛋白表達，減輕線粒體損傷，減少ROS 的產生，抑制NLRP3炎癥小體表達［12］。

綜上所述，ROS 在NLRP3 炎癥小體的啟動與激活兩個過程中都發揮了一定作用。然而，其啟動及激活NLRP3 炎癥小體的具體機制尚未闡明，ROS 作為啟動信號可能的機制是NEK7識別ROS 信號并使下游蛋白質巰基氧化［7］，作為第二信號的機制可能與硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）有關［13］。

兩種激活通路在SAH 中并非單獨出現，有研究證實，ROS 的產生可以激活TLR4-NF-κB 通路［9］。NLRP3 炎癥小體經過上述通路并不能直接成為具有活性的多聚復合物，需要第二信號調控復合物的組裝過程［14］。NLRP3 炎癥小體第二信號主要包括K+外流、Ca2+內流、ROS的形成、溶酶體破裂［15］。其中K+外流作為第二信號對NLRP3 炎癥小體的活化最為重要，其可能是通過影響NEK7 與NLRP3 蛋白的結合，促進NLRP3 炎癥小體的組裝［16］。溶酶體破裂釋放的組織蛋白酶B 促進了NLRP3 炎性小體的激活［2］。目前國內外對于NLRP3炎癥小體的激活及組裝機制這一過程已經有初步研究，但是對于啟動通路與第二信號之間以及第二信號在NLRP3 炎癥小體組裝過程中的作用機制仍需進一步研究。

3 NLRP3炎癥小體在SAH后EBI中的作用

3.1 NLRP3 炎癥小體在SAH 后EBI 中的作用機制

3.1.1 參與神經炎癥級聯反應 NLRP3 炎癥小體在SAH后參與神經炎癥級聯反應，導致EBI的發生。caspase-1 可以將pro-IL-1β、pro-IL-18 轉化為IL-1β、IL-18，促進炎癥級聯反應，加重SAH 后EBI［17］。IL-1是一種促炎癥細胞因子，是炎癥介導的神經元損傷的重要介質。IL-1 及其下游介質（尤其是IL-6）在正常環境下不具有神經毒性，但在SAH 神經病理學狀態下具有顯著毒性。IL-6可導致血管炎癥及破壞內皮細胞屏障作用，還可充當中間體，誘導病變區域炎性細胞聚集，增加ROS 的釋放，與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）協同作用，促進腦血管痙攣及EBI［18］。動物實驗表明，使用IL-1β 抗體中和IL-1 可抑制SAH 小鼠的血管痙攣、小膠質細胞激活及外周白細胞向神經系統浸潤［19］。有學者提出，自噬是可以將老化或受損的細胞器、錯誤折疊或突變的蛋白質分離形成雙層膜泡的自噬體，然后融合到溶酶體中將分離成分降解的一個過程，自噬可以清除IL-1、IL-18 及ROS 從而對炎癥小體的激活起負性調節作用，組裝的NLRP3 炎癥小體也可通過自噬途徑被清除，從而減輕SAH后EBI［20］。

3.1.2 參與小膠質細胞表型轉變 小膠質細胞是參與中樞神經系統固有免疫的重要組成部分，其被激活后分為促炎表型（M1）和抗炎表型（M2）。M1型小膠質細胞分泌IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎細胞因子；M2 型小膠質細胞分泌IL-10 和轉化生長因子-β等抗炎細胞因子，發揮神經保護作用，并有助于神經元再生［21］。SAH 后早期M1 型小膠質細胞占主導地位，隨后向M2 型轉變；促進小膠質細胞向M2 型極化可以改善SAH 后神經炎癥反應［22］。研究表明，抑制NLRP3 炎癥小體活性可促使小膠質細胞由M1 型向M2 型轉變，改善SAH 后神經功能缺損、腦水腫、氧化損傷、神經炎癥和神經細胞焦亡［1］。因此，NLRP3 炎癥小體或可成為小膠質細胞表型轉變的治療靶點，有希望改善患者的EBI。

3.1.3 參與神經細胞焦亡過程 細胞焦亡是炎癥小體所介導的一種特殊的程序性細胞死亡。在SAH后caspase-1可以切割GSDMD生成活化的GSDMD-p30［2］，后者在細胞膜上形成多聚化孔道，細胞內炎性分子細胞內IL-1β 和IL-18 等經該孔道釋放，同時細胞腫脹破裂，導致神經細胞的焦亡。通過抑制GSDMD 蛋白的表達，可減輕神經元變性，改善SAH 后的EBI，減輕神經功能障礙［23］。目前關于SAH 后EBI 中神經元焦亡的知識有限，亟待進一步研究。

3.1.4 參與微血栓形成 SAH 患者尸檢及動物模型中在大腦缺血區域均發現了大量微血栓。微血栓形成被認為是神經系統預后不良的主要原因［24］。SAH 后抑制NLRP3 炎癥小體可以減少微血栓的形成，改善患者的EBI 和遲發性神經功能缺損［25］。有學者認為，微血栓形成的主要原因是炎癥介導的血管內皮細胞凋亡及凝血功能障礙［26］。關于NLRP3炎癥小體在微血栓形成中的機制研究較少，由其介導的炎癥級聯反應導致的微血栓形成，或其自身具有致微血栓形成的作用尚未明確，仍需進一步研究。

3.1.5 參與血腦屏障破壞 血腦屏障的破壞會引起血腦屏障的通透性增加、腦水腫、顱內壓升高、繼發神經元細胞焦亡等，其被認為是腦疝的主要原因，升高SAH 患者病死率。研究發現，NLRP3 炎癥小體與血腦屏障的破壞相關，但其作用機制尚不明確。研究提出，NLRP3 炎癥小體參與血腦屏障的破壞可能是IL-1 介導基質金屬蛋白酶9 降解腦內皮細胞之間的緊密連接蛋白所致［27］。caspase-1-GSDMD 介導的細胞焦亡也參與血腦屏障的破壞，抑制NLPR3 炎癥小體可以保護血腦屏障的完整性［28］。

3.2 NLRP3炎癥小體在EBI治療中的作用

上述證據表明，SAH 可以激活NLRP3 炎癥小體，而炎癥小體的激活通路中抑制其中任何一個靶點均可能減輕神經炎癥和改善SAH 患者的預后，這些藥物大致可以分為四類：作用于NF-κB 通路的藥物、作用于ROS 通路的藥物、NLRP3 炎癥小體特異性抑制劑、其他特殊藥物。

3.2.1 作用于NF-κB通路的藥物 研究發現，SAH后用右美托咪定治療可部分通過抑制TLR4/NF-κB通路來抑制NLRP3 炎癥小體激活，改善神經系統評分，減輕腦水腫，降低血腦屏障的通透性，并上調緊密連接蛋白的表達，減輕SAH 誘導的EBI［29］。氟西汀是一種抗抑郁藥物，其可以抑制抑郁癥患者的NLRP3 小體的激活。氟西汀治療SAH，其作用機制主要是減少M1 型小膠質細胞的數量和外周中性粒細胞浸潤、下調TLR4 的表達、激活自噬作用等，減輕EBI［30］。富氫鹽水在SAH 后發揮抗氧化和抗凋亡作用，其可部分通過Akt/GSK3β 途徑減弱SAH 誘導的神經元凋亡，還可通過抑制NF-κB 通路和促進NLRP3 炎癥小體的失活，抑制EBI 炎癥，改善SAH后的神經行為［4］。二氫硫辛酸治療通過SAH 后EBI中的LAMP1/CaMKII/TAK1通路減輕炎癥并改善神經功能［31］。其主要機制是阻斷TAK1，不僅可以抑制磷酸化NF-κB p65 表達和NLRP3 炎癥小體激活，還能抑制ROS 的產生，并阻止促進自噬的溶酶體組織蛋白酶B 釋放到細胞質中［2］。此外，Resolvin D1（RVD1）是一種從二十二碳六烯酸中提取的脂質介質，具有抗炎和神經保護特性。RVD1 的內源性受體是甲酰肽受體2，通過IκBα 途徑上調脂多糖誘導培養的人內皮細胞中緊密連接蛋白的表達，降低血管通透性。甲酰肽受體2 通過上調TNF-α 誘導蛋白3 來抑制NF-κB 通路激活，阻斷NLRP3 炎癥小體的激活，從而起保護血腦屏障的作用［10］。

3.2.2 作用于ROS 通路的藥物 白黎蘆醇（RSV）與薯蕷皂苷均可通過血腦屏障，是SIRT1 的有效激活劑。SAH 后，SIRT1 通過抑制ROS 介導的NLRP3炎癥小體激活來發揮神經保護作用。RSV還可促進小膠質細胞向M2 表型分化，這可能是抑制小膠質細胞激活及小膠質細胞浸潤的原因［32］。芒果苷（MF）具有改善SAH后神經功能和組織水腫的功能；通過降低脂質過氧化、恢復內源性酶（超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）和增加谷胱甘肽來減輕SAH 誘導的氧化應激；減少SAH 后神經細胞凋亡和腦組織線粒體凋亡途徑的激活；在減輕SAH 后促炎細胞因子的局部釋放的同時，MF 下調NLRP3、ASC 和切割的caspase-1的表達以及NF-κB的激活；MF還可以劑量相關的方式有效上調SAH大鼠大腦中核因子NF-E2相關因子（Nrf2）和血紅素氧化酶1（HO-1）的表達。Nrf2/HO-1 級聯可能是MF 發揮藥理作用的主要途徑。Nrf2/HO-1 級聯促進線粒體相關凋亡蛋白如Bcl-2激活，激活的Bcl-2可以抑制細胞色素C 將procaspase-3 加工成活化的caspase-3。Nrf2/HO-1 級聯也可抑制ROS 的產生，從而抑制NLRP3炎癥小體的激活和組裝［9］。apelin-13 可顯著改善SAH 后神經功能，減輕腦水腫，并維持血腦屏障完整性；顯著改善長期空間學習和記憶；抑制小膠質細胞激活，防止內質網應激過度激活，并降低TXNIP、NLRP3、裂解的caspase-1、IL-1β、TNF-α、髓過氧化物酶和ROS 的水平。其作用機制部分由ROS 通路的TXNIP 抑制NLRP3 炎癥小體激活所介導［13］。銀杏葉提取物已被廣泛應用于各種心腦血管疾病的治療，最近研究發現將銀杏葉提取物用于治療SAH 可改善EBI，其作用機制與TXNIP 的抑制有關［33］。坦螺旋霉素（17-AAG）是熱休克蛋白90（HSP90）的特異性抑制劑。在SAH 后應用17-AAG 可減輕神經炎癥反應、減少微血栓的形成。17-AAG 改善SAH 后的神經功能部分通過HSP90/RIP3/NLRP3 信號通路完成［25］。在此之前一項研究報道，抑制HSP90 可減輕NF-κB介導的炎癥反應［34］。17-AGG 在SAH 后的作用機制仍存在爭議，但其對于NLRP3 炎癥小體激活的抑制作用得到了肯定。

3.2.3 NLRP3 炎癥小體特異性抑制劑 MCC950作為NLRP3 炎癥小體的選擇性抑制劑，在治療炎癥性疾病時對NLRP3 炎癥小體的抑制有效。在SAH后24 h，MCC950 通過抑制NLRP3 炎癥小體減輕EBI。用MCC950 治療大腦血管穿孔的SAH 模型小鼠EBI，神經功能缺損和腦水腫得到改善［5］。

3.2.4 其他藥物 褪黑素（MLT）除是一種重要的晝夜節律分子外，還具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎和抗凋亡。通過自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可以逆轉MLT 對于NLRP3 炎癥小體的抑制作用，MLT 對于炎癥小體的激活主要由自噬介導［35］。研究發現，MLT的抗凋亡作用可以上調Bcl-2表達以及抑制NLRP3 炎癥小體的激活，但其研究結果更傾向于抑制NLRP3 炎癥小體是MLT 抗凋亡調節的主要原因［36］。最新研究結果與之相反，認為上調Bcl-2表達是MLT 抗凋亡調節的主要原因［3］。還有研究提出，氫氣的吸入可以降低SAH 大鼠血管中炎癥和凋亡標志物的表達，減輕腦水腫，抑制微血栓形成和血管痙攣。其分子機制可能與抑制ROS/NLRP3 軸的激活有關［37］。

越來越多的證據表明，NLRP3 炎癥小體激活在SAH 后是一種常見現象。NLRP3 炎癥小體參與了小膠質細胞的激活、促炎性因子的釋放、神經炎癥、血腦屏障的破壞、微血栓的形成以及神經細胞的焦亡。多類藥物可以抑制NLRP3 炎癥小體激活，改善SAH 患者預后，但是目前暫無上述藥物對SAH 后的長期作用及對SAH 的不同嚴重程度收益的研究。NLRP3 炎癥小體可能成為SAH 后的治療靶點，進一步研究其在SAH 后EBI 中的病理機制、研究開發其靶向藥物至關重要，可為改善SAH 后患者預后開辟新的治療途徑。