激肽釋放酶相關(guān)肽酶家族在前列腺癌治療中的研究進(jìn)展

曹步清，刁志宏（通信作者）

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣西 南寧 530011）

2018 年全球新增癌癥病例統(tǒng)計(jì)1 810 萬人，死亡病例960 萬人，其中前列腺癌患者高達(dá)127.6 萬人，死亡35.8 萬，其發(fā)病率和病死率分別為7.1%和3.8%[1]。近年來，隨著我國人民生活方式改變及人口老齡化影響，前列腺癌的發(fā)病率逐年升高，前列腺癌的治療方法得到更多的關(guān)注。激肽釋放酶相關(guān)肽酶家族（kallikrein-related peptidases,KLKs）由人組織激肽釋放酶（Kallikrein-1,KLK1）和激肽釋放酶相關(guān)肽酶（Kallikrein-2 ～Kallikrein-15，KLK2-KLK15）共15 個同源分泌型絲氨酸蛋白酶組成，其中KLK1-2、KLK4-6、KLK8 和KLK10-15 具有胰蛋白酶樣活性，而KLK3/PSA、KLK7 和KLK9具有糜蛋白酶樣活性。該家族由15 個基因（KLK1-KLK15）編碼，定位于19q13.3 ～13.4 染色體上，由于沒有非KLK 基因插入，因此代表人類基因組中最大的蛋白酶基因簇。在KLKs 的DNA 水平和蛋白質(zhì)水平上，KLKs 通常具有30%～80%的序列同源性，盡管家族成員之間的序列顯著相似，但只有KLK2 和KLK12 具有較差的激肽原酶活性，這一特性導(dǎo)致KLK2-KLK15 被描述為激肽釋放酶相關(guān)肽酶。研究表明，KLKs 成員廣泛參與了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，比如在世界各地使用血清PSA（KLK3）篩查男性人群前列腺癌的預(yù)后[2]。本綜述總結(jié)了最新的KLKs（KLK2-15）治療前列腺癌的方法，以期為醫(yī)護(hù)人員治療前列腺癌提供參考。

1.KLKs 在人前列腺中的病理生理學(xué)作用

在前列腺癌中，KLK2 和KLK4 表達(dá)增加，以及由于Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平降低導(dǎo)致Zn2+濃度的降低，還有前列腺微環(huán)境中過度活化的KLK 介導(dǎo)的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，都會促進(jìn)腫瘤發(fā)生和疾病進(jìn)展。KLK2、KLK3/PSA和KLK4 已被證明可以裂解胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBPs），導(dǎo)致前列腺細(xì)胞有絲分裂和抗凋亡刺激增加；而且，KLK2 和KLK4 介導(dǎo)的蛋白酶激活受體（PARs）活化還能增強(qiáng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）的信號傳導(dǎo)和前列腺癌細(xì)胞的增殖。KLK4 在前列腺微環(huán)境中過表達(dá)后，通過抑制雄激素受體（AR）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（PLZF）抑制劑，以及增加白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放來顯著增強(qiáng)AR 和mTOR 信號傳導(dǎo)，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長。此外，KLK4、KLK2 和KLK3/PSA 也被證明通過與AR 共激活劑ARA70 相互作用來增強(qiáng)AR 轉(zhuǎn)錄活化繼而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長。

KLKs 除了在前列腺腫瘤中起致癌作用外，還可以促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和疾病的轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中前列腺相關(guān)KLKs 的過度表達(dá)和活化促進(jìn)下游蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)和ECM 降解，特別是KLK2、KLK3/PSA 和KLK14 直接裂解纖維連接蛋白和層粘連蛋白，而KLK14 也會降解Ⅰ-IV 型膠原，并且KLK2 和KLK4 還能刺激尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）-uPA 受體（uPAR）-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）軸的細(xì)胞外蛋白水解活性，降解ECM。此外，KLK3、KLK4 和KLK7 可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。KLK3/PSA 和KLK4 的活性可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）和甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）的裂解，繼而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞與骨髓內(nèi)皮細(xì)胞的黏附來介導(dǎo)前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。

2.KLKs 靶向療法

KLKs 在人類多種疾病中的關(guān)鍵作用推動了KLK 靶向療法的研究和評估。合成的新型KLKs 活性抑制劑已經(jīng)得到了相當(dāng)廣泛的藥理學(xué)方面的研究，同時也突出了靶向KLKs 療法的巨大治療潛力。目前，工程化KLK 抑制劑、KLK 靶向核酸適體、KLK 活化的前體藥物、基于KLK 的疫苗和免疫療法，都已經(jīng)作為新的基于KLK 的治療方法被研究[3]。

2.1 內(nèi)源性和天然的KLK 抑制劑

由于蛋白酶對其底物的不可逆影響和通過蛋白酶介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生初始刺激的放大作用，對KLKs 精確的組織特異性活性調(diào)節(jié)對于實(shí)現(xiàn)其在正常生理學(xué)中的作用至關(guān)重要。除了其非活性前體（pro-KLKs）的活化外，KLKs 的活性還由廣泛的內(nèi)源性抑制劑控制，包括金屬離子和蛋白抑制劑。（1）Zn2+的抑制作用。Zn2+在調(diào)節(jié)KLKs 活性的能力方面是研究最多的內(nèi)源性陽離子，特別是對于在前列腺中表達(dá)的KLK 家族成員。前列腺液中含有高濃度的Zn2+，Zn2+負(fù)責(zé)KLKs 活性的逆轉(zhuǎn)和變構(gòu)抑制[4]。在前列腺癌中，由于Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平的降低，Zn2+的濃度顯著降低，失去Zn2+介導(dǎo)的調(diào)節(jié)會導(dǎo)致前列腺癌相關(guān)的KLKs，如KLK2、KLK3/PSA、KLK4、KLK7[5]和KLK14 的活性增加，從而促進(jìn)前列腺腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。動物實(shí)驗(yàn)表明，在小鼠模型中注射Zn2+可以減緩前列腺惡性腫瘤生長，延長小鼠的生存時間而不產(chǎn)生嚴(yán)重的不良影響。（2）蛋白抑制劑。研究最多的蛋白類KLK 抑制劑包括絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpins）、Kazal 型抑制劑和Kunitz 型抑制劑。Serpins 通過結(jié)合KLKs 的活性位點(diǎn)，不可逆地破壞大多數(shù)KLKs 的蛋白水解活性，隨后，serpins 被KLKs 切割，促進(jìn)KLKs 結(jié)構(gòu)的重新排列，從而導(dǎo)致了KLKs 活性位點(diǎn)永久破壞。Serpins 家族中最著名的成員有α1-抗胰蛋白酶和α1-抗糜蛋白酶（抑制KLK3/PSA、KLK4、KLK7）、抗凝血酶Ⅲ（抑制KLK2、KLK14）、α2-抗纖溶酶和蛋白酶C 抑制劑（PCI）（抑制KLK2、KLK7-8、KLK12 以及KLK14）[6]。與serpins 不同，Kazal 型和Kunitz 型抑制劑是通過可逆地結(jié)合到KLKs的活性位點(diǎn)來抑制KLKs 的活性，但不破壞KLKs 的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)。在Kunitz 型抑制劑中，研究最多的是抑肽酶（抑制KLK2、KLK4、KLK5、KLK12 和KLK14）和大豆胰蛋白酶抑制劑（抑制KLK4、KLK5、KLK6 和KLK14）。

2.2 內(nèi)源性和天然抑制劑來源的工程化KLK 抑制劑

利用內(nèi)源性和天然的KLK 抑制劑重新設(shè)計(jì)合成的工程化KLK 抑制劑可發(fā)揮它們的抑制機(jī)制，并且能提高其效力、選擇性、組織特異性、免疫原性以及吸收、分布、代謝和排泄。（1）小分子KLK 抑制劑。通過對化學(xué)文庫的高通量篩選合成了多種能夠抑制KLKs 的小化合物，目前已合成了一種單β-內(nèi)酰胺2-氮衍生物和兩種三唑家族化合物來阻斷KLK3/PSA。此外，1、2、4-三唑衍生物也可以抑制KLK5、KLK7 和KLK14，但選擇性和效力都較低。（2）多肽基和蛋白基的KLK 抑制劑。通過添加功能基團(tuán)，如硼酸、肽醛和甲基酮來化學(xué)修飾短的、天然的肽類，可產(chǎn)生基于肽類的KLK 抑制劑。以前列腺癌為例，芐氧羰基-絲氨酸-絲氨酸-賴氨酸-亮氨酸-（硼）亮氨酸選擇性KLK3 肽基抑制劑在小鼠前列腺癌動物模型中能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞生長。除了肽類，大型蛋白酶抑制劑也能被改造為選擇性KLK 抑制劑。瑞士Med Discovery SA 公司以人α1-抗糜蛋白酶為模板，合成了一種能夠抑制前列腺癌相關(guān)KLKs 的絲氨酸蛋白酶抑制劑MDPK67b，特別的是，用KLK2 特異性裂解序列取代α1-抗糜蛋白酶反應(yīng)環(huán)，可增強(qiáng)MDPK67b 介導(dǎo)的對KLK2、KLK4 和KLK14 的特異性抑制。

2.3 基于KLK 的癌癥疫苗和免疫治療

癌癥疫苗旨在重新規(guī)劃和刺激患者的抗腫瘤免疫力，而基于KLK3/PSA 的癌癥疫苗和免疫療法在前列腺癌的治療中取得了非常顯著的效果。PROSTVAC?-VF 病毒載體疫苗由KLK3/PSA 和三個主要的T 細(xì)胞共刺激分子（LFA-3、B7.1 和ICAM-1）轉(zhuǎn)基因組成，目前已證實(shí)PROSTVAC?-VF 可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞和輔助性T 細(xì)胞活化對抗表達(dá)KLK3/PSA 的前列腺癌細(xì)胞，并延緩癌細(xì)胞的增殖和腫瘤生長速率。基于這些發(fā)現(xiàn)，PROSTVAC?-VF 已被批準(zhǔn)進(jìn)入無癥狀或最低癥狀的轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。KLK3/PSA 的腺病毒（adenovirus, Ad）載體疫苗也被研究用于治療前列腺癌。攜帶全長KLK3/PSA基因的復(fù)制缺陷型5 型腺病毒（adenovirus-5, Ad5）被用于刺激抗KLK3/PSA 免疫反應(yīng)。在小鼠動物模型研究中，使用Ad5-KLK3/PSA 可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性CD8 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抑制表達(dá)KLK3/PSA 前列腺腫瘤細(xì)胞生長的作用。此外，臨床Ⅰ期和正在進(jìn)行的Ⅱ期試驗(yàn)表明，該疫苗可以誘導(dǎo)抗KLK3/PSA T 細(xì)胞反應(yīng)，提高接種疫苗的前列腺癌患者的生存率而只伴有輕微和短暫的副作用[7]。利用抗KLK3/PSA 抗體來刺激免疫反應(yīng)的治療方法也被用來評估治療前列腺癌。通過合成抗KLK3/PSA IgG1 和IgE 抗體，可以誘導(dǎo)針對前列腺腫瘤細(xì)胞的T 細(xì)胞活化，繼而抑制腫瘤細(xì)胞生長。KLK4 也是一種能夠誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞反應(yīng)的免疫原性分子，代表了前列腺癌免疫治療另一個新的很有前景的靶點(diǎn)。

2.4 抗KLK 的核酸適體

核酸適體是合成的、具有特異性結(jié)合多肽靶點(diǎn)能力的DNA 或RNA 分子，可以作為藥物制劑和用于診斷目的，將各種毒素和藥物傳遞到特定的組織部位。目前，DNA和RNA KLK3/PSA 特異性適體以及兩個KLK6 特異性DNA適體已被合成用于治療前列腺癌，但它們的治療潛力尚未得到充分評估。

2.5 KLK 活化的前體藥物

前體藥物通常指沒有藥理學(xué)活性的藥物或化合物，在體內(nèi)經(jīng)代謝、酶和/或化學(xué)方法轉(zhuǎn)化為有藥理學(xué)活性的藥物。前體藥物設(shè)計(jì)的基本原理是構(gòu)建一種具有組織特異性活化的治療劑，以降低全身毒性。由于KLK2 和KLK3/PSA 在前列腺特異性表達(dá)和活化，這使其成為前體藥物開發(fā)的理想分子靶點(diǎn)。目前廣泛使用的細(xì)胞毒性藥物/化合物與肽序列的共軛物，如TGX-D1 和L12ADT，可以被KLK2 和KLK3/PSA 識別并分離釋放出活性藥物，并且治療前列腺腫瘤效果良好。前體藥物已成功地用于治療前列腺惡性腫瘤和良性前列腺增生。原氣溶蛋白是嗜水氣單胞菌細(xì)胞溶孔形成氣溶素的非活性前體，用KLK3/PSA 特異性識別位點(diǎn)取代原氣溶蛋白抑制性C 端結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生PRX302 原毒素。PRX302 原毒素會導(dǎo)致產(chǎn)生KLK3/PSA 的前列腺癌細(xì)胞的生存能力降低，并會導(dǎo)致分泌KLK3/PSA 的人類前列腺癌異種移植物完全消退，而不會對鄰近器官產(chǎn)生毒性。此外，在Ⅰ期和Ⅱ臨床試驗(yàn)中，良性前列腺增生患者在前列腺內(nèi)注射PRX302 原毒素后，前列腺體積明顯下降，顯著改善了生活質(zhì)量而只有輕度至中度的副作用。

3.小結(jié)

KLKs 是一個特征典型的分泌型蛋白水解酶家族，參與了人體許多正常的生理學(xué)作用和功能，而KLK 在人類疾病中，主要是在前列腺癌和皮膚病變中的關(guān)鍵作用，推動了KLK 靶向療法的發(fā)展。由于蛋白水解作用的不可逆性，所以嚴(yán)格控制KLKs 的活性對其功能至關(guān)重要。相關(guān)研究已經(jīng)清楚地證明了大多數(shù)KLKs 家庭成員的失調(diào)表達(dá)和激活與廣泛的人類疾病有關(guān)，包括癌癥、皮膚疾病、神經(jīng)退行性變、牙齒成熟缺陷、呼吸道、腎臟和心血管疾病等[8-10]。因此，KLKs 可廣泛用于疾病診斷、患者預(yù)后和治療監(jiān)測。近來，基于KLK 治療前列腺癌的方法已經(jīng)被證明具有顯著的療效，相信在未來KLKs 必將成為治療前列腺癌有效的新靶點(diǎn)。