基于高效液相色譜指紋圖譜和化學模式識別的至寶三鞭丸質量一致性評價

王官連，張詠梅，高文雅，劉佳霖，鮑磊，劉傳文，趙小亮，焦玥，劉洋，王志國，李濤，*，杜茂波*（.中國中醫(yī)科學院中藥研究所，北京 00700；.煙臺中亞至寶藥業(yè)有限公司，山東 煙臺 64000；.中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心，北京 00700）

中藥丸劑系指原料藥物與適宜的輔料制成的球形或類球形固體制劑，主要包括蜜丸、水蜜丸、水丸等[1]。中藥丸劑的使用歷史悠久，眾多使用至今的中醫(yī)名方如六味地黃丸、逍遙丸等均為丸劑。據統(tǒng)計，2020年版《中國藥典》一部收載的1607 種成方或單味制劑中，丸劑有412 種，占比達25%[2]。中藥丸劑的配伍藥味一般較多，且多以飲片細粉直接入藥，輔料用量大，各藥味占比較低，所以中藥丸劑的物質基礎研究更為復雜和困難[2]。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析技術由于其覆蓋性強、操作簡單、使用經濟等特點，在中藥的物質基礎研究方面顯示出巨大的優(yōu)勢[3]。化學模式識別可以對指紋圖譜進行數據降維、識別和分類，強調其相似性和差異性[4]。通過HPLC 指紋圖譜等現(xiàn)代分析技術對中藥的化學組成進行全面表征，進一步利用化學模式識別技術對其相似性或差異性進行分析，是建立中藥丸劑質量評價和控制體系、提升制劑批次間一致性的有效途徑。

至寶三鞭丸，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑》（第十六冊），是由海狗鞭、狗鞭、鹿鞭、人參、淫羊藿等40 多味中藥配伍而成的中藥蜜丸，具有補血生精、健腦補腎等功效[5]，用于治療體質虛弱、腰背酸痛、腎虧遺精、神經衰弱等癥[6-7]。據統(tǒng)計，至寶三鞭丸已在日本、東南亞、歐美等30 多個國家和地區(qū)銷售，使用相當廣泛，對其制劑質量的一致性進行評價至關重要。目前，對至寶三鞭丸的質量控制和物質基礎有一定的研究，如使用薄層色譜對其當歸的定性鑒別、HPLC 對其山茱萸中馬錢苷的含量測定等[8-9]，但這些方法遠不能全面表征其化學組成，制約了至寶三鞭丸制劑批間一致性的評價和進一步質量提升的要求。

前期，本課題組提出了應用“制劑質量標志物”進行中藥制劑質量評價和控制的思路[10-12]，其主要包含以下特點：制劑質量標志物在中醫(yī)藥理論的指導下，依據臨床適應證的要求，按照君-臣-佐-使配伍后產生；制劑質量標志物不在原料階段產生，而在制劑階段產生，由工藝所決定；制劑質量標志物可用于制劑的工藝篩選、質量評價及質量控制；制劑質量標志物與臨床適應證直接相關，其含量高低反映了藥效的高低，也就是產品的優(yōu)劣。本研究以已上市銷售且廣泛應用的中成藥制劑至寶三鞭丸為研究對象，利用HPLC指紋圖譜分析和化學模式識別等技術，對多個批次至寶三鞭丸制劑進行分析，探索中藥丸劑物質基礎全面表征、質量一致性評價策略，為篩選至寶三鞭丸制劑質量標志物提供前期研究基礎。

1 材料

1260 Infinity Ⅱ液相系統(tǒng)（美國Aglient 公司），包括G7111B 四元泵、G7129A 進樣器、G7116A柱溫箱、G7115A DAD 檢測器和OpenLAB CDS 色譜數據系統(tǒng)等；SCIENTZ-18N 型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Integral 5 超純水制備儀（美國Millipore 公司）；甲醇、甲酸（北京Dikma 公司），其他試劑均為色譜級。

15 批次至寶三鞭丸樣品由同一生產廠家按相同的制劑工藝制備，樣品編號（批號）分別為S1（批號：200710）、S2（批號：200811）、S3（批號：200814）、S4（批號：200815）、S5（批號：201018）、S6（批號：201019）、S7（批號：201123）、S8（批號：201124）、S9（批號：201125）、S10（批號：201126）、S11（批號：201128）、S12（批號：201129）、S13（批號：201130）、S14（批號：210301）和S15（批號：210403）（煙臺中亞醫(yī)藥保健酒有限公司）；人參對照藥材（批號：Y09S11H124052）、淫羊藿對照藥材（批號：O21GB165114）（上海源葉生物科技有限公司）；遠志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷等對照品（成都普思生物科技股份有限公司），芍藥苷、蛇床子素等對照品（成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters BEH C18 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～5 min，2%B；5～15 min，2%～50%B；15～45 min，50%～98%B；45～50 min，98%B；50～50.1 min，98%～2%B；50.1～60 min，2%B）； 流速為0.2 mL·min－1；柱溫為35℃；樣品室溫度為6℃；檢測波長為203 nm；進樣量為20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取至寶三鞭丸小蜜丸，剪碎。取剪碎后的小蜜丸樣品約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，稱定重量，振搖至全部溶散，室溫超聲30 min 后，取出，放冷，再次稱定重量，并用75%甲醇補足失重，搖勻，濾過，再取續(xù)濾液2 mL，用水定容至10 mL，搖勻，于20 000 g 離心15 min，上清液即為至寶三鞭丸供試品溶液。

2.3 人參、淫羊藿對照藥材溶液的制備

取人參和淫羊藿對照藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液10 mL，稱定重量，室溫超聲30 min 后，取出，放冷，再次稱定重量，并用75%甲醇補足失重，搖勻，濾過，再取續(xù)濾液2 mL，用水稀釋合適倍數，搖勻，于20 000 g 離心15 min，上清液即為人參（0.005 g·mL－1）和淫羊藿（0.002 g·mL－1）對照藥材溶液。

2.4 對照品溶液的配制

精密稱取各對照品約20 mg，分別置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解，配制成單個對照品儲備液，稀釋合適倍數備用。其中，淫羊藿苷使用50%甲醇溶解和配制。上述對照品溶液均低溫密封保存。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一批次至寶三鞭丸供試品溶液，按“2.2”項下方法制備，連續(xù)進樣6 次，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.12%，相對峰面積RSD＜1.5%，相似度在0.996 以上，表明該儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次至寶三鞭丸樣品，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.10%，相對峰面積RSD＜2.7%，相似度在0.994 以上，表明該方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批次至寶三鞭丸樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、4、8、12 和24 h 進行測定，以18 號淫羊藿苷色譜峰作為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD＜0.11%，相對峰面積RSD＜3.1%，相似度在0.984 以上，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.8 指紋圖譜研究

2.8.1 指紋圖譜共有峰的標定 根據15 批次至寶三鞭丸樣品檢測的HPLC 圖譜，選擇穩(wěn)定性、重復性較好及特征明顯的色譜峰作為共有峰，共標定32 個（峰面積均大于總峰面積0.6%），典型的樣品色譜圖見圖1。其中，18 號色譜峰的分離度好、峰高適中、峰面積穩(wěn)定和保留時間居中（28.5 min），且已鑒定為淫羊藿苷，為至寶三鞭丸功效相關的活性成分[13]，因此選擇18 號峰作為參照峰，計算至寶三鞭丸指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1。

表1 至寶三鞭丸指紋圖譜各共有峰的相對保留時間與相對峰面積Tab 1 Relative retention time and relative peak area of the common peak in fingerprint of Zhibao Sanbian pill

2.8.2 指紋圖譜色譜峰的歸屬和成分指認 取至寶三鞭丸供試品溶液，人參、淫羊藿對照藥材溶液以及各對照品溶液，進樣測定。結果歸屬了淫羊藿和人參對照藥材在至寶三鞭丸中的特征峰，見圖1，可知淫羊藿藥材對至寶三鞭丸的6 號、7號、12 號、18 號、20 號、23 號、27 號、29 號、30 號和32 號峰有貢獻，人參藥材對27 號、28號、29 號和30 號峰有貢獻。在至寶三鞭丸指紋圖譜標定的共有峰中，淫羊藿藥材至少貢獻了10個峰，占總數的近33.3%。通過至寶三鞭丸樣品與對照品的保留時間、紫外吸收光譜特征的比對，指認了至寶三鞭丸指紋圖譜中5 個色譜峰，分別是芍藥苷（7 號峰）、遠志酮Ⅲ（11 號峰）、丹皮酚（16 號峰）、淫羊藿苷（18 號峰）和蛇床子素（21 號峰），見圖1。

圖1 至寶三鞭丸（A）、淫羊藿對照藥材（B）和人參對照藥材（C）的HPLC 圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of Zhibao Sanbian pill（A），Epimedii Folium（B）and Ginseng Radix Et Rhizoma（C）

2.8.3 指紋圖譜的分析與相似度計算 取15 批次至寶三鞭丸供試品溶液，按建立的指紋圖譜方法進行分析，將采集到15 批次指紋圖譜數據以AIA 格式導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以S12 為參照圖譜，利用中位數法，設置時間窗為0.1 min，進行全譜峰匹配，對色譜峰進行多點校正后自動匹配，并進一步手動檢查，生成至寶三鞭丸指紋圖譜疊加圖，見圖2A。對15 批次至寶三鞭丸的指紋圖譜與生成的對照圖譜進行相似度計算，結果相似度為0.841～0.979，見表2，表明至寶三鞭丸各批次樣品制劑的質量一致性尚可。

表2 15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜的相似度分析結果Tab 2 Similarity of fingerprint of Zhibao Sanbian pill

2.9 化學模式識別研究

至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰的峰面積相差較大（相對峰面積范圍0.05～44.77），因此對各共有峰的峰面積進行均一化處理，即用每批次各峰的峰面積值除以15 批次峰面積均值結果表示，進行后續(xù)化學模式識別研究。

2.9.1 系統(tǒng)聚類分析（HCA） 以15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰均一化后的峰面積為變量，輸入OriginPro 2019b 軟件進行HCA 分析，采用平均聚合聚類方法，以平方歐氏距離為分類依據，繪制至寶三鞭丸聚類分析圖，結果見圖2B，可知當歐氏距離為4 時，15 批次至寶三鞭丸制劑聚為一類；當歐氏距離為3 時，15 批次至寶三鞭丸制劑聚為兩類：S14、S12、S11 聚為一類，其他聚為一類。

2.9.2 主成分分析（PCA） 以15 批次至寶三鞭丸指紋圖譜中32 個共有峰均一化后的峰面積為變量，輸入OriginPro 2019b 軟件進行PCA 分析，得到PCA 得分圖。結果見圖2C，可知15 批至寶三鞭丸樣品基本歸為一類，其中S1、S12、S14和S15 相對中心距離較遠，PCA 結果與HCA 結果具有一定相似性。另外，主成分因子載荷矩陣結果表明，14 號峰、28 號峰、15 號峰等對分類有重要貢獻。

圖2 至寶三鞭丸指紋圖譜及對照指紋圖譜（A）、系統(tǒng)聚類分析（B）和主成分分析（C）結果Fig 2 HPLC fingerprints（A），cluster analysis（B）and principal component analysis（C）of Zhibao Sanbian pill

3 討論

中藥丸劑的制備工藝大多以飲片原粉形式入藥，在2020年版《中國藥典》收錄的中藥丸劑中以原粉形式入藥的制劑約占68.93%[1-2]，所以在色譜分析前需要對丸劑的提取方法進行考察。研究考察了熱水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和純甲醇作為提取溶劑，提取時間15、30、60 min 的提取效果，結果使用75%甲醇提取時樣品的色譜峰數目更多、峰高更高，30 min 后各峰基本不再變化。但使用75%甲醇提取后，指紋圖譜色譜圖前段有一定的溶劑效應，出現(xiàn)色譜峰開裂等現(xiàn)象，所以續(xù)濾液進一步用純水稀釋5 倍后再進樣分析。并且在進行人參、淫羊藿對照藥材與至寶三鞭丸制劑比對時，其供試品溶液的制備方法和上述一致，以更客觀分析兩味藥材對至寶三鞭丸指紋圖譜的貢獻。

至寶三鞭丸由40 多味中藥配伍而成，其化學組成極其復雜，每一類成分的最大吸收波長都不同，所以在指紋圖譜的分析中還考察了樣品在203、230、256 和280 nm 波長下檢測效果，結果在203 nm 檢測波長下樣品色譜峰信息最為豐富。這可能是至寶三鞭丸中萜類、苷類成分眾多的緣故[14-15]，因此本研究選擇人參、淫羊藿作為單味對照藥材進行至寶三鞭丸指紋圖譜中各色譜峰的比對，歸屬主要色譜峰。通過優(yōu)化流動相的梯度洗脫方法，至寶三鞭丸和人參、淫羊藿等樣品中主要色譜峰可在60 min 內分離完成。結果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿貢獻了共有峰總數的近33.3%。另外，通過至寶三鞭丸指紋圖譜與人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、淫羊藿苷等30 多種對照品的分析比對，在至寶三鞭丸指紋圖譜中指認了芍藥苷、遠志酮Ⅲ、丹皮酚、淫羊藿苷和蛇床子素等色譜峰，這些成分分別是白芍/芍藥、遠志、牡丹皮、淫羊藿和蛇床子等藥材的特征性成分。研究表明，淫羊藿苷、芍藥苷、遠志酮Ⅲ、丹皮酚和蛇床子素等均具有一定的神經保護作用[13，16-19]，與至寶三鞭丸的藥效相關，因此本研究建立的至寶三鞭丸的指紋圖譜具有一定的代表性。

本研究結果表明15 批次至寶三鞭丸制劑的質量一致性尚可。但是，由于HPLC 指紋圖譜的局限性，“三鞭”中海狗鞭、狗鞭、鹿鞭等的成分可能無紫外吸收，本研究的分析方法尚不能全部表征至寶三鞭丸的化學組成，并且也未對主要色譜峰進行鑒定和定量分析，如對聚類有重要影響的14 號、28 號和15 號峰，所以至寶三鞭丸的物質基礎研究仍需進一步深入。