抗栓膠囊中黃曲霉毒素的含量測定及安全性評價

薛平，顧崢嶸，劉旻虹，李莉（常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，江蘇 常州 213000）

抗栓膠囊由當歸尾、水蛭、土鱉蟲、丹參、烏梢蛇、麝香、馬錢子、骨碎補、僵蠶、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味藥材制成，具有活血化瘀、抗栓通脈之功效；一般用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡證，常用于輔助治療腦血栓、心肌梗死、血栓性靜脈炎等疾病[1-3]。

目前抗栓膠囊的質量研究主要是針對當歸尾、丹參和甘草等藥材的薄層色譜鑒別及丹參酮ⅡA、士的寧等標志成分的含量測定，而安全性探索相對較少[1-3]。抗栓膠囊中含有土鱉蟲生藥粉末，關于土鱉蟲黃曲霉毒素超標的現象時有報道[4-5]。中藥外源性有害物質黃曲霉毒素的檢測和控制是藥品質量控制的重中之重[6]，目前該藥仍未進行過黃曲霉毒素的安全性評估。

黃曲霉毒素（AFT）是公認的超級毒性致癌物，其種類較多，黃曲霉毒素的種類主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1）和M2（AFM2）等，其中AFB1毒性最強，中藥制劑主要涉及AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[5-7]。本文采用免疫親和柱凈化高效液相色譜柱后衍生熒光法（HPLC-FLD）和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS）測定抗栓膠囊中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的殘留量。兩種檢測方法互相驗證，排除干擾，在符合《中國藥典》2020年版要求的前提下，完善檢測方法[7]。通過測定抗栓膠囊樣品中黃曲霉毒素的殘留量，為該藥的質量控制和監管提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A 高效液相色譜儀、RF-20AXS 熒光檢測器（日本島津有限公司）；光化學衍生器（美國AURA）；LCMS-8060 高效液相色譜質譜聯用儀（日本島津）；XP504 電子天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA T25 分散機[艾卡（廣州）儀器設備有限公司]；Thermo Scientific Multifuge X4R Pro 臺式冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。黃曲霉毒素混合對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：610001-202107：AFB1以 1.08 μg·mL－1計算；AFB2以 0.33μg·mL－1計算；AFG1以 1.01 μg·mL－1計算；AFG2以0.30 μg·mL－1計算]。4 種不同品牌3 mL規格的免疫親和柱[廠家分別為VICAM（維康）、ROMER、華安麥科和青島普瑞邦（Pribolab）]，甲醇、乙腈和乙酸銨均為色譜純，水為去離子水，氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和吐溫20 均為分析純?？顾z囊樣品來自全國20 個省級行政區，涉及9 家生產企業（編號A～I），共29批次樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[7-10]

2.1.1 HPLC-FLD 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（16∶16∶68）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：40℃；柱后光化學衍生法：光化學衍生器（254 nm）；檢測器：熒光檢測器，激發波長λex：360 nm，發射波長λem：450 nm。

2.1.2 LC-MS 色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：10 mmol·L－1醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；流速：0.3 mL·min－1，梯度洗脫（0～4.5 min，65%→15%A；4.5～6 min，15%→0%A；6～6.5 min，0%→65%A；6.6～10 min，65%A）；柱溫：25℃；進樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：526℃；DL 管溫度：250 ℃；載氣流速：2 L·min－1；加熱器流量：10 L·min－1；加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L·min－1；采集模式為正離子模式；各化合物監測離子對和碰撞電壓（CE）見表1。

表1 監測離子對、碰撞電壓Tab 1 Monitor ion pair and collision voltage

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備液。

HPLC-FLD 對照品溶液：精密量取上述對照儲備液1 mL，置25 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得。

LC-MS 系列對照品溶液：精密量取對照儲備液適量，用70%甲醇稀釋成含AFB2、AFG2質量濃度為0.03～0.6 ng·mL－1，含AFB1、AFG1質量濃度為0.12～2 ng·mL－1的系列對照品溶液，見表2。

表2 系列混合對照品溶液質量濃度(ng·mL－1)Tab 2 Concentration of series mixed reference solution (ng·mL－1)

2.2.2 供試品溶液[7-8]取抗栓膠囊樣品內容物粉末約5 g，精密稱定，置于均質瓶中，精密加入70%乙腈溶液75 mL，高速攪拌2 min（11 000 r·min－1），4000 r·min－1離心5 min，精密量取上清液7 mL，置50 mL 量瓶中，用緩沖液（稱取8.0 g 氯化鈉、1.2 g 磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀、0.2 g 氯化鉀，加水990 mL 使溶解，用鹽酸調節pH 值至7.0，加水稀釋至1000 mL，即可）稀釋至刻度，搖勻，離心10 min，過濾（用玻璃纖維濾紙過濾），精密量取上清液20 mL，通過免疫親和柱，流速3 mL·min－1，用10 mL 含1%吐溫20 的水洗脫，再用20 mL 水洗脫，棄去洗脫液，再用1.5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.3 系統適用性試驗

2.3.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項下HPLC-FLD 對照品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣5 μL；陰性樣品（未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供試品溶液各進樣20 μL 測定，黃曲霉毒素兩個相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，典型色譜圖見圖1。

圖1 陰性樣品（A）、對照品（B）、供試品（C）的液相熒光色譜圖Fig 1 Liquid phase fluorescence chromatogram of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.3.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液、陰性樣品（未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供試品溶液按“2.1.2”項下色譜條件進樣5 μL 測定，結果各峰形良好，響應高，試驗條件滿足測定要求，典型色譜圖見圖2。

圖2 陰性樣品（A）、對照品（B）、供試品（C）質譜MRM 的TIC色譜圖Fig 2 TIC chromatogram of mass spectrometry MRM of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.4 線性關系考察

2.4.1 HPLC-FLD 分別精密吸取“2.2.1”項下HPLC-FLD 對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X，μL）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表3。

2.4.2 LC-MS 分別精密吸取“2.2.1”項下LC-MS系列對照品溶液進樣5 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣質量濃度（X，ng·mL－1）為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表3。

2.5 精密度試驗

2.5.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項下的HPLC-FLD對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6 針，結果峰面積RSD，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為1.2%、0.92%、0.75%和0.59%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液，按“2.1.2”項下色譜條件連續進樣6 針，計算峰面積RSD，結果AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為6.9%、4.1%、5.1%和2.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取抗栓膠囊樣品（生產企業F，批號：200510），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進行分析，HPLC-FLD 進樣20 μL，LC-MS 進樣5 μL，平行操作6 份。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為5.2%、5.3%、4.3%和4.1%；LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為7.9%、5.9%、6.6%和5.9%，RSD均小于10%，表明本方法重復性良好，兩種檢測方法均可行。

2.7 檢測限與定量限

2.7.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項下HPLC-FLD對照品溶液稀釋至一定的濃度，在 “2.1.1”項下色譜條件進樣分析。以信噪比為10∶1 時相應濃度計算定量限，以信噪比為3∶1 時相應濃度計算檢測限，定量限與檢測限均折算到試樣中被測物能被檢測出的量，結果見表3。

2.7.2 LC-MS 取“2.2.1”項下LC-MS 系列對照品溶液中濃度最低的對照品溶液稀釋至一定的濃度，在 “2.1.2”項下色譜條件進樣分析。以信噪比為10∶1 時相應濃度計算定量限，以信噪比為3∶1 時相應濃度計算檢測限，結果見表3。

表3 線性關系、檢測限和定量限Tab 3 Linear，LOD and LOQ

2.8 穩定性試驗

取抗栓膠囊樣品（生產企業F，批號：200510），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。在0、2、4、6、10、12、16、24 h 時分別按“2.1”項下兩種色譜條件進行分析，HPLC-FLD 進樣20 μL，LC-MS進樣5 μL，計算峰面積RSD。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為1.5%、0.83%、0.57%和0.56%；LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為4.7%、3.3%、6.0%和2.0%，表明供試品溶液穩定性良好，檢測方法可行。

2.9 加樣回收試驗

取抗栓膠囊空白樣品（不含黃曲霉毒素）5 g，平行6 份，精密稱定，精密加入對照儲備液0.5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液后，分別按“2.1”項下兩種色譜條件進行分析，HPLC-FLD進樣20 μL，LC-MS 進樣5 μL，結果HPLC-FLD法平均加樣回收率（RSD）分別為AFG291.79%（1.3%）、AFG188.29%（2.1%）、AFB298.48%（1.3%）、AFB198.82%（1.1%）；LC-MS 法平均加樣回收率（RSD）分別為AFG291.31%（5.8%）、AFG192.54%（4.1%）、AFB299.62%（4.4%）、AFB194.03%（2.8%），表明本試驗準確度良好。

2.10 樣品測定

取不同生產企業的抗栓膠囊樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別采用“2.1”項下色譜條件進行分析，HPLC-FLD 進樣20 μL，LC-MS 進樣5 μL，計算樣品中4 種黃曲霉毒素的含量及其總量，結果見表4。部分超出線性范圍的供試品溶液稀釋后進樣測定。

表4 樣品測定結果(μg·kg－1)Tab 4 Sample determination results (μg·kg－1)

HPLC-FLD 和LC-MS 兩種方法測定結果相對一致，其中液相色譜光化學衍生法HPLC-FLD 成本低，可成為生產企業質量控制方法的首選。《中國藥典》2020年版中將LC-MS 作為黃曲霉毒素測定的驗證結果，故以LC-MS 測定結果統計。AFG2的含量為0～28.946 μg·kg－1，AFG1的含量為0～496.11 μg·kg－1，AFB2的含量為0.029～37.751 μg·kg－1，AFB1的含量為1.115～481.879 μg·kg－1；4種黃曲霉毒素的總量為1.442～1044.686 μg·kg－1。29 批次樣品中黃曲霉毒素檢出率極高，其中AFB1檢出率100%?！吨袊幍洹?020年版中有關黃曲霉毒素的規定均為每1000 g 含AFB1不得過5 μg，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量不得過10 μg。參考此限度，按藥典的數據修約規則，29 批次樣品其中10 個批次樣品AFB1超過5 μg，且AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg；1 批次樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg。29 批次樣品中黃曲霉毒素的不合格率為38%，其中一批次黃曲霉毒素殘留量遠超參考限度，安全風險相對較高。

3 討論

3.1 測定方法的優化

本試驗測定方法主要參考《中國藥典》2020年版2351 真菌毒素測定法項下的黃曲霉毒素測定法，同時進行了部分優化。優化原因主要是抗栓膠囊基質復雜，預試驗發現雜質對待測成分測定干擾較大。免疫親和柱一般要求過柱的作業溶液pH 值為中性，抗栓膠囊初始提取液pH 值大約為5.3，整體偏酸性；過柱的作業溶液要求含甲醇量不超過20%，含乙腈不得過10%。作業溶液pH 值過低或者過高，含有機相過高均不利于免疫親和柱吸附黃曲霉毒素。

前期試驗考察了提取溶劑70%甲醇、80%甲醇、70%乙腈、80%乙腈和1%甲酸的70%甲醇的提取效果，發現70%乙腈提取效率最高。

考察測定量和取樣量的影響：取混合好的抗栓膠囊內容物各5、10、15 g，比較樣品中待測成分的含量，試驗總體結果表明測定稱樣量為5 g 時，已經可以達到測定要求，但每盒樣品中的內容物可能會出現不均勻現象。對比了取樣10、50、100、200 g 的試驗結果，建議每個批次樣品內容物取樣量不少于100 g。

選擇市場上常見的4 種不同品牌的免疫親和柱進行比較，結果表明不同品牌的親和柱對測定影響較小，本試驗方法兼容性良好。

3.2 建議與存在的不足

黃曲霉毒素毒性極強，目前大多不建議設定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量，限量越低越好[10]?？顾z囊組方復雜，組方中有大量的原料藥按《中國藥典》2020年版需要進行黃曲霉毒素限量檢查，限量檢查的品種包括土鱉蟲、蜈蚣、水蛭、蜂房、地龍、醋延胡索、制馬錢子（藥材及生馬錢子飲片要求檢驗）和麩炒僵蠶（藥材及僵蠶飲片要求檢驗）。

部分樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量殘留量極高原因跟生產企業的風險意識不強有關，客觀原因是此次抽檢的樣品生產日期處于2020年版《中國藥典》換版期間，生產企業原料藥均按《中國藥典》2015年版檢驗，這些高危品種大部分在2015年版藥典均未要求進行黃曲霉毒素限量檢查，存在一定的安全監控的漏洞。

為分析抗栓膠囊黃曲霉毒素含量過高的原因，對收到的生產企業B 和企業E 寄送的部分原料和小樣進行了檢測，發現生產企業B 提供的原料蜂房AFG2、AFG1、AFB2和AFB1殘留量較高，嚴重超過了《中國藥典》2020年版蜂房下的標準限度。遺憾的是未能獲得黃曲霉毒素殘留量較高樣品相對應的原料藥，生產企業寄送的部分原料不具有顯著代表性，抗栓膠囊黃曲霉毒素污染的具體原因仍需進一步探究。課題組根據與相關生產企業溝通、日常相關飲片檢驗的數據和文獻[9-12]推測抗栓膠囊黃曲霉毒素污染是上述多種高危原料飲片共同導致的結果，其中土鱉蟲、醋延胡索和蜂房可能是最主要的源頭，蜈蚣、水蛭、地龍、制馬錢子和麩炒僵蠶可能是次要源頭。

抗栓膠囊主要服用人群為老年人，黃曲霉毒素是中藥外源性有害物質量控制的重中之重?；谏鲜鲈囼灲Y果，抗栓膠囊存在黃曲霉毒素污染的安全風險，課題組已向國家藥品監督管理局建議增加抗栓膠囊的黃曲霉毒素限量檢查，加大該藥的安全監控；但此藥的安全質量更需要相關企業加強黃曲霉毒素方面的質量控制的意識，嚴格把控原料的質量，保證用藥安全。