甘草藥渣發酵工藝優化及成分分析、抗氧化活性的研究

呂麗靜，屈青松，周晴，盛夢柯，李智勛，石艷雙，盧建秋*，史新元*（.北京中醫藥大學中藥學院，北京 0488；.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 0488）

隨著中醫藥事業的蓬勃發展，中藥制造業產生了大量中藥藥渣。中藥提取后的藥渣大多被作為廢棄物處理，造成環境污染和資源浪費，藥渣的處理成為目前中藥制藥企業面臨的難題[1-2]。藥渣中除了殘留的藥用成分外，還含有許多有價值的成分，可通過不同的方法將其充分利用。研究表明，藥渣可作為飼料添加劑用于養殖業[3-4]。但藥渣中纖維含量較高，將其直接作為飼料添加劑，活性成分的吸收利用率低，且適口性差[4]，在一定程度上限制了其在養殖業中的應用。

現代微生物發酵技術因其安全、無毒、簡單、效果理想等諸多優點，被廣泛用于農業、醫藥、食品、化工等領域[5]。采用微生物發酵技術對藥渣進行發酵，微生物產生的多種酶系可降低藥渣中纖維素的含量，促進有效成分的析出，提高藥渣利用率[6]。益生菌具有改善或維持健康的功能，可抑制有害細菌增殖，調節腸道菌群平衡，從而發揮機體調節、預防疾病等功效[7]。有研究發現益生菌發酵蒲公英可以提高其抗氧化活性[8]。鑒于上述特點，益生菌可被用作中藥藥渣發酵的菌種。

甘草是常用大宗藥材，有“十方九草”“國老”之美譽。現代研究表明，甘草主要活性成分是三萜皂苷、黃酮和多糖類，具有抗氧化、調節免疫、保肝、抗炎抑菌等多種藥理活性[9-10]。每年有大量甘草被用于生產，隨之產生了大量的甘草固體廢棄物[11]。本文以農業部發布的第2045號公告中規定的可用于飼料微生物添加劑的兩種益生菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）作為發酵菌種進行混合發酵，以甘草藥渣作為發酵基質，以甘草總黃酮含量為檢測指標，采用響應面法優化最佳發酵條件，并分析發酵前后成分含量的變化及抗氧化活性，為甘草藥渣開發利用提供依據，使藥渣的利用更加高效、環保。

1 材料

1.1 儀器

FW-100 型高速粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），Synergy-2 型多功能酶標儀（美國 BIOTEK 公司），PB303-S 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），2695 型高效液相色譜儀（Waters 美國公司），BBS-DDC 型超凈工作臺（北京哈東聯儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

甘草藥渣（北京康仁堂藥業有限公司）。植物乳桿菌（批號：cf201109，江蘇菌鑰生命科技發展有限公司），釀酒酵母（批號：ky2008613，中國典型培養物保藏中心）。對照品甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草素（批號分別為B20417、B20414、B20416、B21525，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（Fisher，色譜級）。

2 方法與結果

2.1 菌種活化及種子液制備

將植物乳桿菌、釀酒酵母菌菌懸液分別劃線于MRS、YM 固體培養基中，并分別于37℃、30℃靜置培養36 h，分離得到單一菌落。挑取單一菌落接種于MRS、YM 液體培養基中，37℃、160 r·min－1培養2 d，獲得發酵用種子液，冷藏備用。

2.2 發酵甘草藥渣培養基的制備

將甘草藥渣粉碎并過40 目篩，稱定10.00 g置于250 mL 錐形瓶中，加去離子水調整料水比為1∶1，121℃、20 min 高壓蒸汽滅菌備用。

2.3 甘草總黃酮含量測定

采用70%的乙醇超聲提取樣品中的總黃酮[12]，利用NaNO2-A1（NO3）3比色法測定總黃酮含量[13]。建立回歸方程：A＝6.5C＋0.0186，R2＝0.9996，利用回歸方程計算總黃酮含量。

2.4 發酵條件優化

圖1 單因素優化試驗結果Fig 1 Single-factor optimization experiment results

2.4.2 響應面優化 依據單因素試驗結果，對接種比例、接種量、發酵溫度、發酵時間4 個因素，各選3 個水平，分別以－1、0、1 進行編碼。采用 Box-Behnken 響應面設計模型，設計4 因素3水平中心組合試驗條件，以總黃酮含量為評價指標，優化復合益生菌發酵甘草藥渣工藝條件。試驗因素水平及編碼見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken 的中心組合因素水平表Tab 1 Factor and level of the central composition of Box-Behnken

表2 Box-Behnken 試驗設計方案及結果Tab 2 Box-Benhnken experiment design and results

應用Design-expert 8.0.6 軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程為：

Y＝1.81＋0.046A＋0.078B＋0.061C＋0.046D＋0.041AB－ 0.055AC＋0.01AD＋0.14BC－0.11BD－0.2CD＋0.047A2－0.17B2－0.14C2－0.13D2。

由表3可知，回歸模型F值為 19.63，P值＜0.0001，表明回歸模型極顯著。方程的相關系數R2＝0.9515，R2＞0.95，說明此模型擬合度較好，能很好地反映真實的實驗情況。失擬項P＝0.0960 ＞0.05，模型失擬項不顯著。模型的調整復相關系數Radj2＝0.9030，說明該模型能解釋約90.30%響應值的變化。

表3 方差分析Tab 3 Variance analysis

根據F值的大小，得出總黃酮含量受各因素的影響次序為：發酵時間（B）＞發酵溫度（C）＞接種比例（A）＞接種量（D）。各因素之間兩兩交互作用對甘草總黃酮含量的影響見圖2。由軟件分析得到，益生菌發酵甘草藥渣最優發酵工藝條件是接種比例釀酒酵母與植物乳桿菌為1∶3、發酵時間48 h、發酵溫度34 ℃、接種量8%，在此條件下甘草總黃酮含量的預測值為1.99%。

圖2 不同因素對甘草總黃酮含量影響的響應面分析圖Fig 2 Response surface analysis of the effect of different factors on the total flavonoid content of licorice

2.4.3 回歸模型的驗證 為驗證模型的可靠性及有效性，對優化后的最佳條件進行3 次重復試驗，得到總黃酮含量為（1.98±0.02）%，與預測值相比無顯著差異，表明預測值和實際值相吻合，優化模型可靠，對實際生產具有一定的指導意義。

對工程實踐能力而言，深入企業頂崗鍛煉與虛擬仿真實習，參與企業技術攻關與承擔企業科研課題，企業掛職與企業調研相結合，促進工科新教師熟悉工程發展動態，豐富工程實踐經驗，發展解決實際工程問題的能力。

此外，試驗測得發酵前總黃酮含量為（1.46±0.09）%，發酵后比發酵前增加了35.62%，說明優化方案設計合理有效，所獲得的培養條件能夠顯著提高總黃酮含量。

2.5 HPLC 測定甘草酸及3 種黃酮類成分含量

2.5.1 色譜條件 采用高效液相色譜法測定甘草酸及3 種黃酮類成分的含量[14]。安捷倫C18色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，流動相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），洗脫梯度（0～10 min，14%～26%B；10～24 min，26%～30%B；24～30 min，30%～34%B；30～35 min，34%～36%B；35～42 min，36%～42%B；42～45 min，42%～50%B；45～60 min，50%～45%B）；流速：1 mL·min－1，柱溫：35℃，檢測波長：254、276、376 nm，進樣體積：20 μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 稱定甘草酸對照品7.97 mg、甘草素對照品2.05 mg、異甘草素對照品2.03 mg、甘草苷對照品2.03 mg，精密加入50%甲醇溶液2 mL 溶解，配制成對照品儲備液。

2.5.3 供試品溶液的制備 稱定未發酵甘草藥渣及發酵甘草藥渣0.50 g，加入25 mL50%甲醇溶液，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱重，用50%甲醇補足減失的重量，離心，取上清液，經 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，得供試品溶液。

2.5.4 樣品成分測定分析 精密吸取對照品溶液和供試品溶液進行測定，記錄峰面積，計算各成分的含量，色譜圖見圖3，含量結果見表4，可見經過發酵后各成分的含量發生了變化。甘草苷及甘草酸含量有所下降，分別下降了63.79%、2.361%；而甘草素和異甘草素的含量有顯著增加，分別增加了855.9%、86.21%。

表4 發酵前后4 種成分的含量變化Tab 4 Content changes of 4 components before and after the fermentation

圖3 混合對照品（A）、未發酵甘草藥渣（B）、發酵甘草藥渣（C）中4 種成分HPLC 圖Fig 3 HPLC of 4 components of mixed reference substance（A），unfermented licorice residue（B），and fermented licorice residue（C）1.甘草苷（liquiritin）；2.甘草素（liquiritingenin）；3.異甘草素（isoliquiritingenin）；4.甘草酸（glycyrrhizic acid）

2.6 抗氧化活性測定

分別稱取一定量的甘草藥渣及發酵產物，加入20 倍去離子水，回流提取2 h，抽濾，濾液冷凍干燥。將冷凍干燥樣品用去離子水制備成不同質量濃度的樣品溶液進行抗氧化活性測定。

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 參照申夢娜等[15]的方法，取DPPH 溶液2 mL，加入不同濃度的樣品溶液2 mL，搖勻，在25℃避光放置30 min，在517 nm 波長處測定其吸光度（A1）。以無水乙醇作為空白對照測定其吸光度（A0），以無水乙醇代替DPPH 測定吸光度（A2），計算DPPH 清除率。

DPPH 清除率（%）＝[1－（A1－A2）/A0]×100%。

2.6.2 羥自由基清除能力 參照沈明花等[16]的方法，依次加入9 mmol·L－1FeSO4溶液500 μL，9 mmol·L－1水楊酸-乙醇溶液500 μL，8.8 mmol·L－1H2O2溶液，37 ℃水浴15 min 后取出，測定510 nm 下吸光度。清除率計算同“2.6.1”項下。數據以平均值±標準差表示，并采用t檢驗進行分析。P＜0.05 認為差異具有統計學意義。

由圖4可知，在一定的濃度范圍內，隨著藥物濃度的增加，其對DPPH、羥自由基的清除率呈上升趨勢，且發酵后甘草藥渣的DPPH、羥自由基清除能力比同濃度的發酵前清除能力顯著提高。說明經過益生菌發酵，甘草藥渣的DPPH 自由基清除能力顯著提升，抗氧化活性增強。

圖4 甘草藥渣發酵前后對 DPPH 和羥自由基清除能力Fig 4 Scavenging effect of licorice residue before and after the fermentation on DPPH and hydroxyl radicals

3 討論

黃酮類成分具有抗氧化、增強免疫功能、抗腫瘤等藥效作用[17]。中藥發酵具有提高藥物有效成分含量，增強藥效的作用。經過復合益生菌發酵，甘草藥渣中總黃酮含量增加，通過對發酵工藝的優化，提取液中總黃酮含量得以提升。根據微生物的生長代謝特點，推測造成總黃酮含量提升可能是由于發酵過程中微生物分泌的酶類破壞了植物細胞壁，從而提高了提取率。利用微生物發酵甘草藥渣，提高藥渣中活性物質的溶出，可促進藥渣的吸收利用，為生產藥渣飼料添加劑提供參考，實現資源再利用。

發酵應用于中藥，能利用微生物分解轉化能力，增強或產生新的功效，使得中藥更適應于臨床用藥的需要。馬超等[18]研究用酵母發酵大黃使結合型蒽醌分解或者轉化成游離型蒽醌，從而減輕大黃的峻烈瀉下作用。杜靜[19]研究發現冠突散囊菌可使中藥三七皂苷類成分發生轉化作用。甘草藥渣發酵前后物質成分發生變化，可能是由于益生菌生物使這幾種物質成分之間發生了相互轉化。

甘草中的黃酮類物質分為游離苷元和結合型糖苷兩大類。為進一步研究益生菌發酵過程對甘草渣中黃酮類成分的轉化作用，本文通過高效液相色譜分析發現，經發酵后3 種黃酮類成分含量均有一定的變化。糖苷類成分甘草苷含量降低，苷元類成分甘草素和異甘草素含量增加。造成這種現象的原因可能是益生菌分泌的纖維素酶等酶分解了糖苷類成分，轉化為更易被吸收的游離性苷元，從而使甘草素和異甘草素含量增加。大分子的黃酮糖苷類被分解成小分子苷元更容易被機體吸收[20]，可進一步提高飼料利用率。

研究表明，氧化應激與疾病有直接關系，氧化與抗氧化機制失衡會造成動物抗病能力下降，從而引起疾病的發生[21]。因此增強機體抗氧化能力，可提高動物健康水平。陳學紅等[22]發現乳酸菌發酵能提高金銀花的抗氧化活性。本研究發現復合益生菌發酵后的甘草藥渣對DPPH 自由基、羥自由基有一定的清除能力，且在相同濃度下都強于未發酵組。可能是由于益生菌的生物轉化作用，物質成分發生變化并產生初級、次級代謝產物，從而發揮抗氧化作用[23]；同時益生菌產生SOD 酶等酶類發揮作用，從而增強抗氧化活性[24]。

但不同企業之間產生的藥渣在成分方面是否有差異尚未知。關于益生菌發酵藥渣的應用范圍需進一步深入研究。

綜上所述，復合益生菌發酵甘草藥渣具有較大的應用價值，為甘草藥渣的再利用提供了可能。本研究也可以為企業的藥渣資源再利用提供新思路，提高中藥資源的綜合利用價值。