兩種外泌體提取方法的比較以及外泌體對(duì)低氧肺動(dòng)脈高壓肺血管重構(gòu)的作用

郭峰，黃寧，，胡長平（.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450052；2.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院藥理學(xué)系，長沙 40078）

外泌體（exosomes，Exos）是細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷形成包含管腔小體的多泡體，并通過與細(xì)胞膜融合釋放到細(xì)胞外的異質(zhì)性細(xì)胞外囊泡，異質(zhì)性體現(xiàn)在其細(xì)胞起源、大小、內(nèi)容物和對(duì)靶細(xì)胞的作用[1]。細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷時(shí)的不均一性導(dǎo)致了外泌體大小的異質(zhì)性，通常認(rèn)為外泌體是直徑為40～160 nm 的膜性囊泡[1]。提取高純度外泌體是外泌體相關(guān)研究的首要環(huán)節(jié)，而外泌體大小的異質(zhì)性是導(dǎo)致提取外泌體純度不足的主要原因。目前，常用的外泌體提取方法包括超高速差速離心法、試劑盒法、蔗糖密度梯度離心法和免疫磁珠捕獲法等，其中超高速差速離心法和試劑盒法在基礎(chǔ)性研究中應(yīng)用最為廣泛。本研究對(duì)比了超高速差速離心法和試劑盒法對(duì)外泌體的提取效果，以期為后續(xù)外泌體相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種靜息狀態(tài)下平均肺動(dòng)脈壓力＞20 mmHg，肺血管阻力≥3 Wood 單位的進(jìn)行性疾病[2]。肺血管重構(gòu)是PH 的典型病理特征，是引起肺血管壓力和阻力升高的主要原因，其潛在機(jī)制尚未完全闡明[3]。肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）在PH 肺血管重構(gòu)中均發(fā)揮重要作用。PH 時(shí)，內(nèi)膜損傷可致PAECs 發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelialmesenchymal transition，EndMT），發(fā)生EndMT 后的PAECs 腫脹變大且失去緊密連接，增殖和促炎能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮屏障破壞和內(nèi)皮功能紊亂[4-5]；PASMCs 由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型，獲得增殖、遷移、分泌活性物質(zhì)和胞外基質(zhì)等特點(diǎn)，從而促進(jìn)中膜肥厚[6-7]。本課題組前期研究表明，PAECs-EndMT 和PASMCs 表型轉(zhuǎn)化均可促進(jìn)低氧PH 肺血管重構(gòu)[8-9]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，外泌體通過直接作用于肺血管細(xì)胞或介導(dǎo)肺血管細(xì)胞相互作用而參與PH 肺血管重構(gòu)[10-14]。然而，外泌體是否通過調(diào)控PAECs-EndMT 和PASMCs 表型轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)PH 肺血管重構(gòu)，目前尚未見報(bào)道。本研究提取低氧PH 大鼠血漿源性外泌體并分別作用于PASMCs和PAECs，檢測其對(duì)PASMCs 表型轉(zhuǎn)化和PAECs-EndMT 的作用，以期進(jìn)一步闡明PH 的發(fā)病機(jī)制，為PH 的防治提供參考和新思路。

1 材料

1.1 儀器與試藥

胎牛血清、DMEM 高糖培養(yǎng)基（以色列Bioind公司），EGM2 內(nèi)皮培養(yǎng)基（瑞士LonZa 公司），Exo-Quick-TC 試劑盒（美國SBI 公司），CD63 抗體、PCNA 抗體（武漢Proteintech 公司），CD9 抗體、TSG101 抗體、CD31 抗體（美國Abcam 公司），PKH67（美國Sigma 公司），α-SMA 抗體（美國CST公司），SM22α（武漢ABclonal 公司）。

小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（Vevo2100）、超高速離心機(jī)（美國Beckman 公司），IJ-6A 臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國Beckman-Coulter 公司），激光共聚焦顯微鏡、倒置顯微鏡（德國蔡司公司），生物型透射電子顯微鏡（美國FEI 公司），Zatasizer 粒徑分析儀（英國Malvern 公司），低氧艙（長沙長錦科技有限公司），ChemiDoc XRS＋成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，雄性，180～220 g（動(dòng)物許可證號(hào)：No.CSU2017009，中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部），常規(guī)飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 低氧誘導(dǎo)PH 大鼠模型

SD 大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為常氧對(duì)照組和低氧模型組，每組10 只。校準(zhǔn)并設(shè)置低氧倉氧含量為10%，低氧3 周以建立低氧PH 大鼠模型[8，15]。模型建立期間，將鈉石灰和無水氯化鈣置于低氧艙底部以吸收二氧化碳和水分，并及時(shí)更換。常氧對(duì)照組大鼠以氧含量21%處理3 周。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由進(jìn)食、飲水。

2.2 大鼠右心室收縮壓測定方法

稱量大鼠體質(zhì)量，2%戊巴比妥鈉（60 mg·kg－1，腹腔注射）麻醉，固定麻醉大鼠于解剖板上。右心導(dǎo)管法測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）。大鼠頸正中偏右找到并鈍性分離右頸總靜脈，絲線結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)心端，用眼科鑷挑起右頸總靜脈并用顯微剪刀剪出V 型切口，將PE 軟導(dǎo)管（外徑為0.96 mm，內(nèi)徑為0.58 mm）從V 型切口插入，并緩慢推進(jìn)，用成都泰盟BL410 系統(tǒng)記錄波形。導(dǎo)管首先到達(dá)右心房并出現(xiàn)心房波，此時(shí)輕微地上下、旋轉(zhuǎn)導(dǎo)管以進(jìn)入右心室，直至出現(xiàn)心室波，待波形穩(wěn)定1 min 左右后，記錄RVSP。

2.3 原代大鼠PASMCs 的培養(yǎng)

采用貼壁法培養(yǎng)常氧大鼠原代PASMCs。雄性SD 大鼠，180～220 g，稱重，麻醉，取出肺動(dòng)脈置于磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液中；快速去除肺動(dòng)脈纖維外膜，轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)皿，加入適量含20%血清的高糖培養(yǎng)基；沿主干和分支輕柔地剪開肺血管，小心刮落內(nèi)皮層細(xì)胞，用剪刀將處理后的肺血管剪碎；利用牙科探針將剪碎的肺血管碎塊快速在培養(yǎng)瓶底部鋪開；加入含20%血清的高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5 d；牙科探針小心去除組織塊，加入20%血清的高糖培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d；胰酶消化，使用第3～6 代PASMCs 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 原代大鼠PAECs 的培養(yǎng)

采用免疫磁珠分選法培養(yǎng)常氧大鼠原代PAECs。雄性大鼠，250～300 g，稱重，麻醉，取出肺動(dòng)脈置于PBS 中；快速去除肺動(dòng)脈纖維外膜，轉(zhuǎn)移至干凈培養(yǎng)皿，加入適量膠原酶，剪碎肺動(dòng)脈，37℃消化1 h，每5 min 振蕩混勻一次；加入適量5% EGM2 內(nèi)皮培養(yǎng)基終止消化，200 目篩網(wǎng)過濾以去除未完全消化的組織塊；加入CD31-FITC 內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白抗體，室溫避光孵育15 min；加入10 μL 免疫磁珠，室溫避光孵育15 min；2500 r·min－1離心10 min，棄上清液，500 μL buffer 重懸；約3 mL buffer 潤洗分選柱，將buffer 重懸的細(xì)胞懸液加入分選柱，自由留下，3 mL buffer 清洗分選柱3 次；加入5 mL 5%EGM2 內(nèi)皮培養(yǎng)基，使用活塞快速推出細(xì)胞；將推出的細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化，使用第1～6 代PAECs 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 試劑盒法提取PASMCs 源性外泌體

收集PASMCs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃300 g 離心10 min；3000 g 離心15 min；12 000 g 離心45 min；0.22 μm Millipore 過濾器過濾；將上清液轉(zhuǎn)移至超濾管，3000 g 離心20 min，濃縮細(xì)胞上清液；將濃縮后的細(xì)胞上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管，加入Exo-Quick-TC 試劑，翻轉(zhuǎn)混勻，4℃過夜；1500 g 離心30 min，沉淀外泌體；100 μL PBS 重懸外泌體，4℃冰箱備用。為避免引入雜質(zhì)，本課題中凡涉及外泌體所使用的PBS，均用0.22 μm Millipore 過濾器過濾。

2.6 超高速差速離心法提取外泌體

2.6.1 超高速差速離心法提取PASMCs 源性外泌體 收集PASMCs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃300 g 離心10 min；3000 g 離心15 min；12 000 g 離心45 min；120 000 g 離心2 h；移液槍小心移除廢棄上清，PBS 重懸外泌體；0.22 μm Millipore 過濾器過濾外泌體重懸溶液；吸取過濾后的外泌體重懸溶液于干凈超速離心管中，PBS 配平，4 ℃120 000 g 離心70 min；100 μL PBS 重懸外泌體，4℃冰箱備用。

2.6.2 超高速差速離心法提取PAECs 源性外泌體 收集PAECs 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提取方法同“2.6.1”項(xiàng)下PASMCs 源性外泌體。

2.6.3 超高速差速離心法提取血漿源性外泌體收集常氧和低氧大鼠血漿于含抗凝劑EDTA 的采血管，4 ℃，2000 g 離心10 min 獲得血漿；提取方法同“2.6.1”項(xiàng)下PASMCs 源性外泌體。

2.7 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)

外泌體懸液和2%多聚甲醛按1∶1 混合，滴于干凈塑料薄膜上，將正面電鏡碳網(wǎng)扣在液滴上，4℃靜置20 min，去離子水洗滌；1%戊二醛處理2 min，去離子水洗滌；醋酸雙氧鈾負(fù)染90 s，烤干碳網(wǎng)，上機(jī)檢測。

2.8 Western blot 分析檢測外泌體標(biāo)志蛋白的表達(dá)

用50 μL 蛋白裂解液重懸外泌體，冰上渦旋裂解30 min；12 000 r·min－1，4℃離心15 min，將上清液吸取至干凈的200 μL EP 管。按照BCA試劑盒法測定蛋白質(zhì)濃度。配制SDS-PAGE，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗CD9（1∶2000）、CD63（1∶2000）、TSG101（1∶2000）過夜，孵育二抗，顯影，成像。

2.9 粒徑分析儀檢測外泌體粒徑

將超高速差速離心得到的外泌體重懸于PBS溶液，4℃保存；選擇一次性干凈的樣品池，對(duì)光使用無塵紙擦拭確保光路上無顆粒附著外管壁；緩慢注入外泌體并避免氣泡，蓋子封住樣品池；將樣品池放入儀器，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行儀器檢測。

2.10 激光共聚焦檢測PASMCs 和PAECs 對(duì)外泌體的攝取

超高速差速離心法得到外泌體后，小心去除上清液，用0.5 mL Diluent C 重懸外泌體；加入4 μL PKH67 至重懸了外泌體的Diluent C 溶液中，混勻，常溫避光孵育4 min；2 mL 1% BSA 溶液終止染色；轉(zhuǎn)移染色后的外泌體溶液于干凈的超離管中，PBS 配平，4℃120 000 g 離心70 min，以去除殘余染料；小心移除廢棄上清液，100 μL PBS 重懸外泌體；將PKH67 標(biāo)記的外泌體加入激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)的PASMCs 或PAECs 中，培養(yǎng)箱中孵育12 h；加入500 μL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定20 min；加入500 μL DAPI 染色液，室溫染色5 min；激光共聚焦拍照，記錄。

2.11 免疫熒光檢測PASMCs 表型轉(zhuǎn)化和PAECs-EndMT 標(biāo)志蛋白的表達(dá)

從培養(yǎng)箱中取出處理完成的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌；每孔加入100 μL 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，PBS 洗滌；每孔加入100 μL TritonX-100，室溫透化10 min，PBS洗滌；每孔加入100 μL 1% BSA，室溫封閉1 h；4℃孵育一抗CD31（1∶200）、α-SMA（1∶200）、PCNA（1∶400）過夜，PBS 洗滌；室溫孵育相應(yīng)二抗1 h，PBS 洗滌；每孔加入50 μL DAPI 染液，室溫染色5 min，PBS 洗滌；顯微鏡拍照、記錄。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的Student’st檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0 軟件，雙側(cè)P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 試劑盒法提取PASMCs 源性外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，提取的PASMCs外泌體樣本中僅觀察到直徑約10 nm 的囊泡，而未觀察到直徑為40～160 nm 的膜性囊泡（見圖1A）。Western blot 結(jié)果顯示，提取的外泌體樣本中檢測不到外泌體標(biāo)志蛋白CD63 和TSG101 的表達(dá)（見圖1B）。納米微粒示蹤分析結(jié)果顯示，粒徑40～160 nm 的顆粒僅占33%，其余顆粒粒徑分布于3～10 nm 或160～600 nm（見圖1C）。綜上，試劑盒法提取的PASMCs 源性外泌體純度不高。

圖1 透射電子顯微鏡（A）、蛋白質(zhì)免疫印跡（B）和納米微粒示蹤分析（C）鑒定試劑盒法提取的PASMCs 源性外泌體Fig 1 Transmission electron microscope（A），Western blot（B）and nanoparticle tracing analysis（C）to identify PASMCs-derived exosomes by the kit method

3.2 超高速差速離心法提取PASMCs 源性外泌體的鑒定

透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，外泌體呈典型的“杯狀”結(jié)構(gòu)，粒徑約為100 nm（見圖2A）。Western blot 檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD63 和TSG101，發(fā)現(xiàn)CD63 和TSG101 在外泌體中呈高表達(dá)（見圖2B）。納米微粒示蹤分析結(jié)果顯示，粒徑40～160 nm 的顆粒所占百分比大于98%（見圖2C）。綜上所述，超高速差速離心法提取的PASMCs 源性外泌體純度較高，優(yōu)于試劑盒法。

圖2 透射電子顯微鏡（A）、蛋白質(zhì)免疫印跡（B）和納米微粒示蹤分析（C）鑒定超高速差速離心法提取的PASMCs 源性外泌體Fig 2 Transmission electron microscope（A），Western blot（B）and nanoparticle tracing analysis（C）to identify PASMCs-derived exosomes by the ultra-high speed differential centrifugation

3.3 超高速差速離心法提取PAECs 源性外泌體的鑒定

Western blot 檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9，發(fā)現(xiàn)CD9 在提取的外泌體中呈高表達(dá)，而在PAECs 細(xì)胞碎片中基本不表達(dá)（見圖3A）。納米微粒示蹤分析結(jié)果顯示，粒徑40～160 nm 的顆粒所占百分比大于99%（見圖3B）。綜上所述，超高速差速離心法提取的PAECs 源性外泌體純度較高。

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡（A）和納米微粒示蹤分析（B）鑒定超高速差速離心法提取的PAECs 源性外泌體Fig 3 Western blot（A）and nanoparticle tracing analysis（B）to identify PAECs-derived exosomes by the ultra-high speed differential centrifugation

3.4 超高速差速離心法提取血漿源性外泌體鑒定

以常氧為例，透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，外泌體呈典型的“杯狀”結(jié)構(gòu)，粒徑約為100 nm（見圖4A）。Western blot 檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9，發(fā)現(xiàn)CD9 在血漿源性外泌體中呈高表達(dá)（見圖4B）。納米微粒示蹤分析結(jié)果顯示，粒徑40～160 nm 的顆粒所占百分比大于98%（見圖4C）。綜上所述，超高速差速離心法提取的血漿源性外泌體純度較高。

圖4 透射電子顯微鏡（A）、Western blot（B）和納米微粒示蹤分析（C）鑒定超高速差速離心法提取的大鼠血漿源性外泌體Fig 4 Transmission electron microscope（A），Western blot（B）and nanoparticle tracing analysis（C）to identify plasma-derived exosomes by the ultra-high speed differential centrifugation

3.5 低氧構(gòu)建PH 大鼠模型

與常氧對(duì)照組（21%O2，21 d）相比，低氧模型組（10%O2，21 d）大鼠體質(zhì)量顯著降低，RVSP顯著升高，右心室重量/（左心室＋室間隔）重量RV/（LV＋S）、右心室重量/脛骨長度（RV/tibial length）顯著升高（見圖5A～E）。同時(shí)，多普勒超聲檢測結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，低氧模型組大鼠肺動(dòng)脈壁厚度（PAWT）與右心室壁厚度（RVWT）顯著升高，而肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間/肺動(dòng)脈血流射血時(shí)間（PAT/PET）與三尖瓣環(huán)收縮期位移（TAPSE）顯著降低（見圖5F～M）。HE 染色結(jié)果顯示，與常氧對(duì)照組相比，低氧模型組大鼠肺血管明顯增厚，管腔狹窄（見圖5N～P）。綜上，低氧誘導(dǎo)PH 大鼠模型成功。

圖5 體質(zhì)量（A）、右心室收縮壓（B～C）、右心室重構(gòu)指數(shù)（D～E）、超聲心動(dòng)圖指標(biāo)（F～M）及肺血管重構(gòu)指標(biāo)（N～P）確認(rèn)低氧（10%O2，21 d）誘導(dǎo)PH 大鼠模型構(gòu)建成功（**P＜0.01）Fig 5 Body weight（A），right ventricular systolic pressure（B～C），indexes of right heart remodeling（D～E），indexes of echocardiography（F～M） and indexes of pulmonary arterial remodeling（N～P） to confirm the successful construction of PH rat model induced by hypoxia（10%O2，21 d）（**P＜0.01）

3.6 血漿源性外泌體對(duì)PASMCs 表型轉(zhuǎn)化的作用

首先，用PKH67 標(biāo)記的血漿源性外泌體孵育SD 大鼠原代PASMCs 12 h，激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明外泌體可進(jìn)入原代大鼠PASMCs（見圖6A）。接下來，分別用常氧大鼠血漿源性外泌體（Exos-Normoxia）和低氧大鼠血漿源性外泌體（Exos-Hypoxia）孵育常氧培養(yǎng)的大鼠PASMCs 24 h。免疫熒光結(jié)果顯示，相對(duì)于Exos-Normoxia，Exos-Hypoxia 處理的PASMCs 中收縮型標(biāo)志蛋白α-SMA 表達(dá)顯著降低，而增殖型標(biāo)志蛋白PCNA表達(dá)顯著升高（見圖6B～C）。由此認(rèn)為，Exos-Hypoxia 可誘導(dǎo)PASMCs 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。

圖6 激光共聚焦和免疫熒光分別檢測PASMCs 對(duì)PKH67 標(biāo)記外泌體的攝取（A）和低氧大鼠血漿源性外泌體對(duì)PASMCs 表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白α-SMA 和PCNA 表達(dá)的影響（B～C）Fig 6 Laser confocal microscopy for the uptake of PKH67-labeled exosomes by PASMCs（A）and immunofluorescence for the expression of phenotypic transformation biomarkers α-SMA and PCNA in PASMCs（B～C）

3.7 血漿源性外泌體對(duì)PAECs-EndMT 的作用

首先，用PKH67 標(biāo)記的血漿源性外泌體孵育SD 大鼠原代PAECs 12 h，激光共聚焦實(shí)驗(yàn)證明外泌體可進(jìn)入原代大鼠PAECs（見圖7A）。接下來，分別用Exos-Normoxia 和Exos-Hypoxia 孵育常氧培養(yǎng)的大鼠PAECs 24 h。免疫熒光結(jié)果顯示，相對(duì)于Exos-Normoxia，Exos-Hypoxia 處理的PAECs 中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD31 表達(dá)顯著降低，而間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白α-SMA 表達(dá)顯著升高（見圖7B～C）。由此認(rèn)為，Exos-Hypoxia 可誘導(dǎo)PAECs 發(fā)生EndMT。

圖7 激光共聚焦和免疫熒光分別檢測PAECs 對(duì)PKH67 標(biāo)記外泌體的攝取（A）和低氧大鼠血漿源性外泌體對(duì)PAECs 間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白CD31 和α-SMA 表達(dá)的影響（B～C）Fig 7 Laser confocal microscopy for the uptake of PKH67-labeled exosomes by PAECs（A）and immunofluorescence for the expression of EndMT biomarkers CD31 and α-SMA in PAECs（B～C）

4 討論

本研究旨在比較試劑盒法和超高速差速離心法提取外泌體的純度，并探究血漿源性外泌體在PH 發(fā)病機(jī)制中的作用，揭示外泌體調(diào)控PH 肺血管重構(gòu)的潛在機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① 相較于試劑盒法，超高速差速離心法提取外泌體的純度顯著升高；② 超高速差速離心法可提取高純度的PASMCs、PAECs 和血漿源性外泌體，適用性強(qiáng)；③ Exos-Hypoxia 可進(jìn)入PASMCs，誘導(dǎo)PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化；④ Exos-Hypoxia 可進(jìn)入PAECs，誘導(dǎo)PAECs 發(fā)生EndMT。

外泌體相關(guān)研究的首要環(huán)節(jié)是提取高純度外泌體。目前，常用的外泌體提取方法有超高速差速離心法、試劑盒法、蔗糖密度梯度離心法和免疫磁珠捕獲法等。現(xiàn)將上述幾種方法進(jìn)行如下對(duì)比（見表1）。雖然蔗糖密度梯度離心法和免疫磁珠捕獲法能夠得到更高純度外泌體，但耗時(shí)長、費(fèi)用高且操作復(fù)雜，不適于大規(guī)模開展實(shí)驗(yàn)。本研究比較了超高速差速離心法和試劑盒法，通過透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)、納米微粒示蹤分析檢測外泌體粒徑分布、蛋白質(zhì)免疫印跡檢測外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)，提示超高速差速離心法提取的外泌體純度顯著優(yōu)于試劑盒法。此外，本研究也利用超高速差速離心法分別提取PASMCs、PAECs 和血漿源性外泌體，發(fā)現(xiàn)均能得到較高純度的外泌體。提示超高速差速離心法實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定，適用性強(qiáng)，操作性高，提取外泌體的純度理想，可用于各項(xiàng)外泌體相關(guān)基礎(chǔ)性研究中。

表1 幾種常用外泌體提取方法的對(duì)比Tab 1 Several extraction methods for exosomes

外泌體作為一種40～160 nm 的膜性囊泡，通過其豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸內(nèi)容物對(duì)毗鄰或遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞發(fā)揮多樣的生物學(xué)作用如炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖與遷移、血管新生等，從而參與高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心肌肥大等心血管疾病的進(jìn)程[16-19]。研究表明，外泌體也參與介導(dǎo)PH 的發(fā)生、發(fā)展，這可能與外泌體中的微小RNA 和蛋白質(zhì)內(nèi)容物相關(guān)。外泌體可調(diào)控多種細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化進(jìn)程，包括間質(zhì)細(xì)胞上皮化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、EndMT 和平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等[20-22]。但目前外泌體與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和EndMT 間的相關(guān)報(bào)道較少。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）源性外泌體可上調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human aortic smooth muscle cells，HASMCs）中收縮型標(biāo)志蛋白（α-SMA、Smoothelin、Calponin）的表達(dá)[23]；miR143/145 可通過HUVECs 源性細(xì)胞外囊泡傳遞至HASMCs，從而調(diào)控HASMCs 表型轉(zhuǎn)化[24]；外泌體可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向鈣化表型轉(zhuǎn)化[25-26]。視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞源性外泌體抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs 發(fā)生EndMT，這可能是因?yàn)橥饷隗w中的miR-202-5p 傳遞至HUVECs 并調(diào)控TGF/Smad 信號(hào)通路[27]。黑色素瘤細(xì)胞源性外泌體可促進(jìn)HUVECs 發(fā)生EndMT[28]。MSC 源性外泌體可抑制PAECs 和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT[20，29]。在上述研究基礎(chǔ)上，本課題構(gòu)建了低氧PH 大鼠模型，并提取Exos-Normoxia 和Exos-Hypoxia。將Exos-Normoxia 和Exos-Hypoxia孵育常氧培養(yǎng)的大鼠PASMCs 和PAECs，通過免疫熒光檢測PASMCs 和PAECs 中表型轉(zhuǎn)化和EndMT 標(biāo)志蛋白表達(dá)變化，證明Exos-Hypoxia 可促進(jìn)PASMCs 表型轉(zhuǎn)化，也可促進(jìn)PAECs 發(fā)生EndMT。

綜上所述，超高速差速離心法雖然需要配備超高速離心機(jī)，但獲得的外泌體純度顯著優(yōu)于試劑盒法。試劑盒法提取外泌體的純度不理想，且價(jià)格昂貴，研究者應(yīng)斟酌使用。此外，超高速差速離心法提取的低氧大鼠血漿源性外泌體可進(jìn)入PASMCs 和PAECs，促進(jìn)PASMCs 表型轉(zhuǎn)化和PAECs 發(fā)生EndMT，從而促進(jìn)PH 肺血管重構(gòu)。此研究進(jìn)一步闡明了PH 的發(fā)病機(jī)制，為防治PH提供參考和新思路。