木欖胚軸總黃酮通過調節PI3K/Akt信號通路誘導人結腸癌HT-29細胞凋亡

陳美先，卓清緣，柴民偉，王健松，王羚酈*（.廣州中醫藥大學 中藥學院，廣州 50006；.北京大學深圳研究生院環境與能源學院，廣東 深圳 58055）

據世界衛生組織統計，2020年結直腸癌在全球的發病率排第三，病死率排第二[1]。目前西醫治療腫瘤以手術、放化療、分子靶向、內分泌治療及一些新輔助治療等綜合治療為主[2-3]，但因其毒副作用大且預后差而具有一定的局限性。因此，在植物中尋找天然抗腫瘤活性物質一直是抗腫瘤藥物研究的熱點。

木欖（Bruguiera gymnorrhiza）是紅樹科木欖屬植物，是一種傳統海洋藥用植物，已被《中國藥用植物志》《海洋藥物》《現代本草綱目》等中草藥專著收載。據記載，木欖的葉、胚軸、樹皮等部位均可入藥，主要功效有清熱解毒、止瀉、消炎、收斂、止血、截瘧等[4-6]。目前已有研究表明木欖胚軸中的一些化合物具有體外抑制肺癌細胞增殖的作用[7]，但對其他腫瘤細胞是否具有生長抑制作用，未見相關報道，抗腫瘤的分子機制也尚未完全闡明。

細胞周期和細胞凋亡在人類組織的正常發育和平衡中發揮著重要作用，同時也與許多疾病狀態有關，包括癌癥[8]。中藥總黃酮提取物是一類潛在的抗腫瘤有效成分[9-11]。在前期研究中初步發現了木欖胚軸的總黃酮（total flavoniods fromBruguiera gymnorrhizahypocotyls，TFBH） 成分具有體外抗結腸癌活性。因此，本研究從木欖胚軸中提取、富集了總黃酮成分，首次探究TFBH對人結腸癌HT-29 細胞增殖和遷移的影響，并結合細胞周期和細胞凋亡共同探究其作用機制，為進一步闡明木欖胚軸的抗腫瘤活性及其作用機制提供參考和依據。

1 材料

1.1 細胞株

人結腸癌細胞株HT-29（武漢普諾賽生命科技有限公司）。采用含10%胎牛血清和含1%雙抗生素的McCoy’s 5A 培養基培養細胞，置于37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養。

1.2 試藥

TFBH：用10 倍量的70%乙醇在室溫下超聲提取1.0 kg 木欖胚軸干燥粉末，過濾后將提取液旋轉蒸發濃縮，用適量的水將濃縮后的浸膏溶解，于D101 大孔樹脂上分離，分離條件為50%乙醇，低溫濃縮干燥后用二甲基亞砜（DMSO）制備成125 μg·μL－1的儲備液，置于4℃密封保存；以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法[12]測定TFBH 的總黃酮含量為83.02%。所用植物部位于2021年采于深圳福田紅樹林保護區，經北京大學環境與能源學院柴民偉教授鑒定。

McCoy’s 5A 培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；雙抗生素（美國Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（德國PAN-Biotech 公司）；蘆丁（HPLC ≥98%）、D101 大孔吸附樹脂（上海源葉生物科技有限公司）；MTT（德國BioFroxx 公司）；DMSO（MP Biomedicals LLC.）；Hoechst 33258、Tris-甘氨酸-SDS-電泳緩沖液（Biosharp 生物科技有限公司）；細胞周期試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海貝博生物公司）；RIPA 裂解液、蛋白上樣緩沖液（5×）、無蛋白快速封閉液（5×）（上海雅酶生物科技有限公司）；無蛋白快速轉膜液（20×）（蘇州新賽美生物科技有限公司）；胰酶消化液、蛋白marker（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；PVDF 膜（美國Millipore 公司）；ECL 化學發光液、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗體、HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗（Affinity Biosciences LTD）。

1.3 儀器

多功能酶標儀（型號Multiskan GO，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BD LSRFortessa 流式細胞儀（美國BD 公司）；熒光顯微鏡[型號BX53，奧林巴斯（中國）有限公司]；SDS-PAGE 電泳儀[型號EP300，韋克斯（北京）科技有限公司]；全自動化學曝光分析系統（型號COMPLEX2000，Bioworld 公司）。

2 方法

2.1 MTT 法檢測細胞增殖情況

取對數生長期的HT-29 細胞以合適的細胞密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃，5%CO2的恒溫培養箱中貼壁培養24 h。棄去原培養基并加入含0.2%DMSO 的培養基和不同質量濃度TFBH（25、50、100、200、250 μg·mL－1）的含藥培養基，每組6 個復孔，繼續培養12 h、24 h 和48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態變化后，每孔加入20 μL MTT（PBS 稀釋至 5 mg·mL－1），置于恒溫箱中繼續培養4 h。4 h 后吸棄上清，每孔加150 μL 的DMSO 以溶解由活細胞代謝產生的甲瓚產物，搖床上震蕩10 min，用多功能酶標儀在570 nm 波長處檢測各孔的吸光度（A）。使用GraphPad 軟件計算細胞增殖抑制率及IC50值。

2.2 劃痕實驗

將HT-29 細胞以合適密度接種于6 孔板中，置于培養箱中培養，待細胞密度至90%左右，使用直尺和200 μL 槍頭在每個孔中進行輕微的直線劃痕，用PBS 清洗細胞碎片。根據給藥濃度分為3 組，以接近1 倍IC50值作為高劑量組（62.5 μg·mL－1），以接近4/5 倍IC50值作為中劑量組（50 μg·mL－1），以接近3/5 倍IC50值作為低劑量組（37.5 μg·mL－1）。加入含有TFBH 藥物（37.5、50、62.5 μg·mL－1）的完全培養基2 mL，對照組加入等體積的培養基，在顯微鏡下進行拍照，記錄細胞0 h、24 h 的遷移距離，用Image J軟件分析遷移能力，計算HT-29 細胞的遷移率。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期

取對數生長期的HT-29 細胞消化并計數，接種于6 孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。加入質量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養基，每組設3 個復孔，處理細胞24 h。胰酶消化細胞，計數，離心。用500 μL PBS 重懸細胞，緩慢滴加2 mL 預冷的無水乙醇固定細胞，4℃放置過夜。根據細胞周期試劑盒步驟進行染色，流式細胞儀檢測結果。每組實驗重復3 次，Modfit 軟件分析細胞生長各期的所占比例。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率

選取生長狀態良好的HT-29 細胞消化并計數，接種于6 孔板中，接種密度5×106個/孔，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。加入質量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養基。作用24 h后使用無EDTA 的胰酶消化并收集細胞。按照Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒說明書操作細胞染色，流式細胞儀分析結果。每組實驗重復3次，Flow Jo V10 軟件分析Annexin V-FITC 陽性細胞所占比例，即細胞凋亡率。

2.5 Hoechst 33258 染色觀察細胞凋亡

取對數生長期的HT-29 細胞，調整密度為1×105個·mL－1的細胞懸液。將制備好的細胞懸液接種于加入細胞爬片的12 孔板，每孔1 mL，輕微晃動，使細胞均勻鋪在爬片上。24 h 后棄去原培養液，加入1 mL 質量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養基，培養24 h。吸棄培養液，PBS 漂洗1 min×2 次；4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3 min×2 次；每孔加入Hoechst 33258 染色劑30 μL，室溫條件下避光染色10 min。染色完畢，PBS 漂洗3 min×2 次。在紫外光340 nm 的波長處激發，顯微鏡下觀察不同組別的熒光強度情況。

2.6 Western blot

取對數生長期的HT-29 細胞，接種于6 孔板中，接種密度5×106個/孔，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。加入質量濃度分別為37.5、50、62.5 μg·mL－1的TFBH，對照組加入等體積的培養基，處理24 h 后提取細胞總蛋白。將細胞置于冰上，加入RIPA 裂解液裂解30 min，12 000 r·min－1、4℃離心10 min。取上清液分裝于1.5 mL 離心管中，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性后于－80℃保存。蛋白上樣后SDSPAGE 電泳，快速轉膜，轉膜后快速封閉10 min；孵育一抗，4℃放置過夜，TBST 清洗10 min×3次；二抗室溫孵育1.5 h，TBST 清洗10 min×3次；ECL 化學發光，于全自動化學曝光分析系統內進行曝光，分析各組蛋白表達情況。

2.7 統計學分析

應用SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、Image J 等軟件對實驗數據進行分析，每組實驗重復3次，結果用均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，如滿足方差齊性用LSD分析，若不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TFBH 對HT-29 細胞增殖能力的影響

結果顯示，TFBH 對HT-29 細胞有生長抑制作用，呈時間和濃度依賴關系（見圖1）。TFBH作用于結腸癌HT-29 細胞12 h、24 h 和48 h 后的IC50值分別為（307.80±4.28）、（178.30±7.00）、（63.37±8.42）μg·mL－1，可見TFBH 對HT-29 細胞增殖抑制的最佳時間為48 h。在光學顯微鏡下觀察TFBH 作用HT-29 細胞48 h 后的細胞形態，結果顯示隨著給藥濃度增大，細胞界限模糊，細胞皺縮變小的程度逐漸加深，見圖1。

圖1 TFBH 對HT-29 細胞增殖的影響（×100）Fig 1 Effect of TFBH on the proliferation of HT-29 cells（×100）

3.2 TFBH 對HT-29 細胞遷移率的影響

利用劃痕實驗檢測TFBH 是否抑制HT-29 細胞發生遷移，結果見圖2，細胞遷移率隨TFBH給藥濃度的增加而降低。與對照組比較，50、62.5 μg·mL－1TFBH 組的細胞遷移率差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001），可見TFBH 能夠抑制HT-29 細胞發生遷移。

圖2 TFBH 對HT-29 細胞遷移的抑制作用（×40）Fig 2 Inhibitory effect of TFBH on HT-29 cell migration（×40）

3.3 TFBH 對HT-29 細胞周期的影響

TFBH 對HT-29 細胞周期中各個時期所占比例的影響見圖3。結果顯示，與對照組相比，TFBH 給藥組的G0/G1期和G2/M 期的比例呈上升趨勢，S 期的比例呈下降趨勢，其中TFBH 62.5 μg·mL－1組的G0/G1期、S 期和G2/M 期與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。以上結果說明，TFBH 可誘導HT-29細胞周期發生G0/G1期和G2/M 期阻滯。

圖3 TFBH 對HT-29 細胞周期的影響Fig 3 Effect of TFBH on cell cycle of HT-29 cells

3.4 TFBH 對HT-29 細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測結果如圖4所示。TFBH 給藥組均可誘導HT-29 細胞發生不同程度的凋亡。與對照組比較，TFBH 各給藥組的凋亡率差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖4 TFBH 對結腸癌HT-29 細胞凋亡的影響Fig 4 Effect of TFBH on apoptosis of HT-29 cells

3.5 TFBH 對細胞凋亡形態的影響

Hoechst 33258 染色后在熒光顯微鏡下可觀察到活細胞細胞核呈彌散均勻的弱藍色熒光，凋亡細胞核可見致密濃染的亮藍色熒光。結果顯示，對照組細胞核形態較為一致，顯弱藍色熒光。與對照組相比，TFBH 各給藥組處理細胞后，均能觀察到亮藍色熒光的細胞核數量有所增加（見圖5），各組凋亡細胞核的熒光強度與TFBH 給藥濃度成正相關。

圖5 TFBH 對HT-29 細胞凋亡形態學的影響（×200，×400）Fig 5 Effect of TFBH on morphological features of apoptosis of HT-29 cells（×200，×400）

3.6 TFBH 對凋亡相關蛋白表達的影響

如圖6所示，TFBH 各給藥組作用HT-29 細胞24 h 后，凋亡相關蛋白Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 表達均有上調趨勢，Bcl-2 蛋白表達下調，并且存在濃度依賴性。與對照組相比，TFBH 各給藥組的cleaved caspase-3/caspase-3 以及50、62.5 μg·mL－1TFBH 組的Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9 相對蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖6 TFBH 對細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響Fig 6 Effect of TFBH on the expression levels of cell apoptosis related proteins

3.7 TFBH 對PI3K/Akt 信號通路蛋白的影響

通過檢測PI3K/Akt 信號通路相關蛋白表達水平探究其是否參與TFBH 對細胞凋亡的影響，結果如圖7所示。與對照組相比，TFBH 處理24 h后，該通路關鍵蛋白p-PI3K 和p-Akt 的表達量顯著降低，TFBH 各給藥組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 相對蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.001）。

圖7 TFBH 對PI3K/Akt 信號通路相關蛋白表達水平的影響Fig 7 Effect of TFBH on the expression levels of related proteins in the PI3K/Akt signaling pathway

4 討論

4.1 實驗方法分析

MTT 實驗證明TFBH 抑制HT-29 細胞增殖的最佳時間為48 h，而本研究在其他實驗中的藥物處理時間為24 h 的原因是，在實驗過程中，當給藥處理時間為48 h 時，6 孔板中的中、高劑量組的貼壁細胞出現大片脫落，懸浮在培養液中，這種情況對細胞凋亡指標的檢測會產生較大的影響和誤差；而當處理時間為24 h 時，貼壁細胞發生脫落的情況較少、程度較輕，綜合流式細胞實驗的結果可以看出，給藥處理24 h 后，低、中、高劑量組的凋亡率與對照組間有明顯的差異，所以統一將給藥處理時間定為24 h。

4.2 實驗結果分析

本研究從細胞周期、細胞凋亡表型實驗評價TFBH 抑制HT-29 細胞增殖和遷移的主要作用。從實驗結果來看，TFBH 能明顯抑制HT-29 細胞增殖，但抑制HT-29 細胞的遷移能力相對較弱。TFBH 可以阻滯HT-29 細胞周期中的G0/G1期和G2/M 期，但僅高劑量組的作用效果較為明顯。本研究中的Hoechst 33258 細胞核染色和流式細胞術實驗共同證明了TFBH 各劑量組均可誘導HT-29 細胞發生凋亡，并且提示在給藥時間為24 h 時，TFBH 主要誘導HT-29 細胞發生早期凋亡。以上結果表明，TFBH 誘導HT-29 細胞發生凋亡比阻滯其細胞周期的作用更為明顯。因此，本研究中機制探究的重點在于TFBH 如何誘導HT-29細胞發生凋亡。

4.3 機制研究

PI3K/Akt 信號通路作為一個關鍵的信號轉導通路，在控制細胞生長、增殖和凋亡中扮演著重要的角色。PI3K 激活后可以通過磷酸化Akt的thr308 位點激活Akt[13]。磷酸化Akt 通過調節Bcl-2 蛋白家族來控制細胞凋亡[14]。活化的Akt 可以磷酸化Bad 蛋白的ser136 位點，導致Bcl-2 的釋放，與Bax 結合形成二聚體，或者磷酸化Bax 蛋白的ser184 位點，與Bcl-2 結合形成二聚體。因此，上述兩種由Akt 引起的Bcl-2 蛋白家族的磷酸化方式都可以起到抑制凋亡的作用[15-16]。另一方面，細胞凋亡是一種自主細胞程序性死亡，受外源途徑和內源途徑控制，其中涉及線粒體的內源途徑是細胞凋亡的重要途徑之一[17]。Bcl-2 蛋白家族與線粒體凋亡途徑密切相關，是改變線粒體內膜通透性的重要調控因子，稱為線粒體通透性轉換孔[18]。根據細胞凋亡過程中不同的功能，Bcl-2 蛋白家族可分為促進細胞凋亡的Bax 蛋白亞家族和抑制細胞凋亡的Bcl-2蛋白亞家族[19]，通過調節促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比例，特別是Bax/Bcl-2 的比例，可以促進或抑制凋亡。本研究表明，TFBH 可通過上調Bax/Bcl-2 的比例從而促進凋亡。

Caspase 是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的蛋白酶家族。當Bcl-2 蛋白家族誘發線粒體凋亡時，線粒體受損釋放細胞色素C，pro caspase-9 可以和細胞色素C 以及Apaf1 形成復合物，同時被激活。激活的caspase-9（cleaved caspase-9）可以激活細胞凋亡的關鍵酶caspase-3，進一步激活后續的細胞凋亡信號[20]。Caspase-3 是細胞凋亡過程中最關鍵的執行分子之一，可以剪切細胞凋亡過程中的許多關鍵蛋白，例如PARP。Caspase-3 的激活需要從沒有活性的全長caspase-3，在asp28 和ser29 之間及asp175 和ser176 之間進行剪切，產生有活性的cleaved caspase-3。因此caspase-3 的激活常被作為細胞凋亡的一個重要指標[21]。本研究結果顯示，TFBH 各給藥組中的cleaved caspase-9/caspase-9、cleaved caspase-3/caspase-3 相對蛋白表達上升，說明TFBH 很可能是通過caspase 級聯反應激活caspase-9，然后激活caspase-3，從而促進細胞凋亡。

4.4 總結

本研究發現，TFBH 可以在體外抑制人結腸癌HT-29 細胞的增殖和遷移。TFBH 能通過阻滯HT-29 細胞周期的G0/G1期和G2/M 期以及誘導HT-29 發生凋亡抑制細胞生長。TFBH 誘導細胞凋亡的作用機制與抑制PI3K/Akt 信號通路有關，通過上調Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9/caspase-9以及cleaved caspase-3/caspase-3 的表達激活線粒體內源性凋亡途徑并進一步激活caspase 級聯反應，誘發細胞凋亡。但本研究并未考察TFBH 對HT-29 細胞侵襲的作用，也沒有深入探究TFBH阻滯細胞周期的作用機制，這將成為今后研究的方向。另有研究表明，PI3K/Akt 與mTOR 蛋白的關系密切，PI3K/Akt/mTOR 通路同樣可以調控細胞凋亡，甚至是細胞自噬[22-25]。因此在今后的研究中，還可結合相關實驗證明TFBH 在抑制腫瘤生長過程中是否促進或抑制細胞發生自噬。