雪蓮果浸膏對高脂模型大鼠腸道脂質吸收的影響及機制*

孫見飛， 龔順航， 姚龍鳳， 殷文鳳， 章先旭， 劉俊奇， 李蓉， 吳遵秋

(貴州醫科大學 基礎醫學院， 化學與生物化學實驗室， 貴州 貴陽 550025)

代謝綜合征主要包括高血壓、高血糖和血脂異常等一些臨床綜合征[1-2]，會顯著增加心血管事件的風險。近年來，代謝綜合征的發病率逐年遞增，高脂血癥已成為危害人們健康的重要因素[3-4]。目前，治療高脂血癥的臨床藥物主要是他汀類和貝特類，這類藥物雖然具有降脂作用，但是其不良反應也不可忽視[5-6]，因此新型降脂藥物的研發越來越備受關注，尋求能實現“以食代藥”的產品也成為近年來研究的新熱點。有研究發現，雪蓮果具有抗氧化、抑菌、抗動脈粥樣硬化、降血脂及降血壓等作用[7-8]，在我國雪蓮果更多是作為水果食用，對其藥理學活性的研究甚少[7-8]。本研究通過網絡藥理學對雪蓮果活性成分-高脂血癥靶點-網絡通路進行初步預測，采用不同濃度雪蓮果浸膏對高脂模型大鼠灌胃，探討雪蓮果浸膏對高脂模型大鼠腸道脂質吸收的分子機制，為雪蓮果實現“以食代藥”的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1實驗動物及藥物 80只7周齡SD(Sprague Dawley)大鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號 SYXF(黔)2018-0001，雌雄各半，潔凈級，體質量180～220 g。高脂高糖飼料購自重慶騰鑫生物科技有限公司，其主要成分為普通飼料(72.8%)、豬油(15%)、蔗糖(10%)、膽固醇(2%)及三號膽鹽(0.2%)；雪蓮果購自貴陽市水果市場，奧利司他購自貴陽凱信生物工程有限公司。

1.1.2主要儀器及試劑 總甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)試劑盒由深圳子科生物科技有限公司提供，大鼠低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol, HDL-C)試劑盒均購買于安徽巧伊生物科技有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；全功能酶標儀(美國伯樂公司)、4 ℃低溫高速離心機(美國Thermo Fisher公司)、凝膠成像系統(美國Synoptics公司)、ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 研究方法

1.2.1雪蓮果有效成分和靶基因的預測 雪蓮果化學成分由文本挖掘法獲取(Demeshko OV, 2018;Silva MFGD, 2017;袁曉艷, 2017;Yan X, 1999; Simonovska B, 2003)，將結果輸入TCMSP數據庫(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://www.tcmspw.com/tcmsp.php)以化合物吸收、分布、代謝、排泄(ADME)參數進行篩選，以生物利用度(oralbioavailability,OB)>30%、且類藥性(drug-likeness, DL)>0.16為篩選標準，所得即為雪蓮果的有效成分。利用PubCHEM數據庫(PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性成分SMILES結構式，輸入Swiss Target Prediction數據庫(swiss target prediction，http://www.swiss target prediction.ch/)預測其潛在靶基因，并與TCMSP數據庫中的成分靶基因進行整合，所得即為雪蓮果的靶基因。

1.2.2高脂血癥相關基因及治療靶點的預測 在OMIM(online mendelian inheritance in man，https://omim.org/)、Genecards(genecards: the human gene database，https://www.genecards.org/)、DisGeNET(disgenet- a database of gene-disease associations，https://www.disgenet.org/)數據庫檢索高脂血癥(hyperlipoidemia)的疾病靶點，對3個數據庫的結果進行整合，獲得高脂血癥相關基因；將雪蓮果靶基因與疾病相關基因取交集，即為雪蓮果干預高脂血癥的治療靶點。

1.2.3蛋白相互作用及MCODE分析 將治療靶點輸入STRING數據庫(STRING，https://string-db.org/)進行蛋白互作分析，設置“Minimum required interaction score”為 0.4，利用R語言依據靶點相互作用數量對其進行排序，將結果導入cytoscape 3.8.0作圖。使用MCODE插件對其進行核心模塊分析，設置參數Degree Cutoff=1、Node Score Cutoff=0.2、K-Core=2。

1.2.4富集分析 利用R語言基于KEGG與GO的注釋對治療靶點進行富集分析，其中GO富集分析包含分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組成(cellular component，CC)3個層面，并對KEGG富集分析結果利用cytoscape 3.8.0軟件繪制“成分-靶點-通路“圖。

1.2.5動物分組及高脂模型的建立 將80只SD大鼠隨機為空白組(20只)和高脂模型組(60只)，空白組用基礎飼料喂養，高脂模型組用高脂高糖飼料飼養；8周后，分別在空白組和高脂模型組隨機取10只麻醉、主動脈取血后處死，3 000 r/min離心分離血清檢測TG、TC含量，模型組大鼠TG、TC含量較空白組增高時，提示造模成功；50只高脂模型大鼠再均分為模型組、陽性對照組及雪蓮果浸膏(高、中、低)組，每組10只。

1.2.6雪蓮果浸膏的制備 取新鮮雪蓮果2.5 kg，清水沖洗干凈后切片、漂洗0.5 h，于電磁爐上連續浸提4 h，收集并過濾浸提液并蒸發濃縮，最后分裝、滅菌，4℃存儲，用后續研究。

1.2.7給藥方案 結束造模后的第2天開始通過灌胃途徑進行給藥，雪蓮果浸膏高、中、低劑量組大鼠分別取5、2.5及1.25 mg/g雪蓮果浸膏(按生藥量計)[9]，加蒸餾水稀釋至4.5 mL進行灌胃，陽性對照組以奧利司他0.03 mg/g(4.5 mL)的劑量進行灌胃[10]，空白組和模型組直接用4.5 mL的生理鹽水灌胃，均連續給藥8周。

1.3 觀察指標

1.3.1酶聯免疫吸附測定法(ELISA)血清中TG、TC、LDL-C及HDL-C的含量 各組大鼠麻醉后心臟采血，3 000 r/min離心分離血清采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定各組大鼠血清TG、TC、LDL-C及HDL-C含量。

（1）重復發表的文獻；（2）非臨床隨機對照研究（如動物實驗、綜述、個案報道或單臂臨床試驗等），或半隨機對照試驗；（3）非藥物試驗（如認知行為療法、催眠療法及飲食干預等）；（4）試驗設計有明顯錯誤或無法提取信息的文獻。

1.3.2實時熒光定量RT-PCR檢測胰脂肪酶、輔脂酶 mRNA表達 給藥結束后的第2天，各組大鼠麻醉處死后，用Trizol法提取大鼠胰腺組織的總RNA，逆轉錄合成cDNA。胰脂肪酶、輔脂酶和內參照GAPDH的引物序列如表1所示。按照試劑盒的說明書進行qPCR反應，擴增條件為：95 ℃ 預變性5 min， 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共進行40循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，進行溶解曲線分析。

表1 各基因的引物序列

1.3.3Western blot 測定胰腺組織中胰脂肪酶、輔脂酶的蛋白水平 給藥結束后的第2天，各組大鼠麻醉處死后，取20 mg胰腺組織于200 μL組織裂解液中提取總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度，配置好分離膠和聚集膠后，用5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)樣品緩沖液按1 ∶4稀釋樣品，95 ℃加熱變性5 min，取20 μL上樣，電泳分離目的蛋白，轉聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenef uoride，PVDF)，5%的TBST脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，室溫振搖60 min。ECL顯色，計算胰脂肪酶、輔脂酶的相對表達量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 網絡藥理學

2.1.1雪蓮果的活性成分和靶點分析 如表2所示，雪蓮果(yacon)化學成分由文本挖掘法獲取，利用TCMSP數據庫篩選ADME參數，其中23個成分被數據庫錄入，共5個化合物符合OB>30%、且DL>0.16標準，可以認為是雪蓮果的活性成分。結合Swiss Target Prediction在線工具和TCMSP數據庫據測的雪蓮果5個活性成分的靶基因，其中yacon1包含105個、yacon2包含107個、yacon3包含109個、yacon4包含60個、yacon5包含34個。

表2 雪蓮果的活性成分及相關信息

2.1.2高脂血癥靶點收集與交集靶點 如表3所示，整合OMIM、Genecards、DisGeNET數據庫預測的高脂血癥疾病相關基因，共獲得262個高脂血癥相關基因。將雪蓮果靶基因與疾病相關基因取交集共計獲得34個共同基因，即為雪蓮果干預高脂血癥的靶點。

表3 不同數據庫來源的高脂血癥相關基因

續表

2.1.3蛋白質相互作用分析及MCODE分析 將34個交集靶點輸入STRING數據庫進行蛋白互作分析,互作關系如圖1A所示，節點顏色越深靶點相互作用數量越多，圖1B展示了前10位靶點的相互作用數量及其排序；MCODE分析發現有3個核心作用模塊，如圖1C所示。由APOA1、HMGCR、CYP2C9、CYP2C19、ALOX5及PPARG組成的模塊具有最高的評分，各元素間相互作用緊密，各模塊參數如表4所示。

注：A為交集基因蛋白互作PPI網絡圖，B為前10位靶點的相互作用數量及其排序，C為交集蛋白組成的三核心模塊。

表4 核心模塊參數

2.1.4富集分析 基于KEGG與GO的注釋進行富集分析，結果如圖2A、2B所示，其中GO富集分析包含BP、CC、MF三個層面。KEGG富集分析中，膽固醇代謝(cholesterol metabolism)、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)以及脂肪的消化和吸收(fat digestion and absorption)等信號通路被顯著富集；在GO富集分析中脂質分解代謝(lipid catabolic process)、類固醇分解代謝(steroid metabolic process)以及脂質分解代謝調控(regulation of lipid metabolic process)等生物過程，膽固醇轉移活性(cholesterol transfer activity)、羧酸酯水解酶活性(carboxylic ester hydrolase activity)以及甾醇轉移活性(sterol transfer activity)等分子功能被顯著富集，據此推測，脂質、類固醇和膽固醇代謝可能是雪蓮果治療高脂血癥的重要機制。為進一步確定雪蓮果治療高脂血癥的主要分子機制，進行了“成分-靶點-通路”分析(圖2C)，結果顯示，膽汁轉換脂肪酶、載脂蛋白A(APOA)及載脂蛋白B(APOB)參與了上述的脂質、類固醇和膽固醇代謝過程。膽汁轉換脂肪酶即胰脂酶，包括胰脂肪酶和輔脂酶兩種，因此推測胰脂肪酶和輔脂酶可能直接參與了脂質代謝的過程，在后續的動物實驗中，將重點探討胰脂肪酶和輔脂酶的變化，及其對脂質代謝的影響。

注：A為KEGG富集分析結果，B為GO富集分析結果，C為成分-靶點-通路網絡。

2.2 動物實驗

表5 雪蓮果浸膏對大鼠體質量的影響

2.2.2血清TC、TG、LDL-C及HDL-C含量 造模第8周時，與空白組比較，高脂模型組大鼠血清中TG和TC含量明顯較高，差異有統計學意義(P<0.05)，證明大鼠高脂模型已成功建立(表6)。進一步對各組大鼠的血脂進行測定結果發現，造模第16周時，與空白組比較，模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C及HDL-C含量增高(P<0.05)；與模型組比較，雪蓮果浸膏高劑量組和陽性對照組的血清中TG、TC、LDL-C及HDL-C含量有明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表7。

表6 造模第8周時各組大鼠血清TG和TC水平

表7 雪蓮果浸膏對各組大鼠血脂TG, TC, LDL-C 和 HDL-C的影響

2.2.3大鼠胰腺組織中胰脂肪酶和輔脂酶 mRNA表達 結果顯示，與空白組相比，模型組的胰脂肪酶、輔脂酶 mRNA表達升高；在雪蓮果浸膏和陽性藥物的治療下，雪蓮果高劑量組、中劑量組和陽性對照組的胰脂肪酶、輔脂酶 mRNA表達較模型組有所降低(P<0.05)，且雪蓮果高劑量組和陽性對照組相比于雪蓮果中劑量組，降低效果更加顯著。見圖3。

注： (1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

2.2.4大鼠胰腺組織胰脂肪酶、輔脂酶蛋白表達 結果顯示，與空白組相比，模型組的胰脂肪酶和輔脂酶蛋白表達升高(P<0.05)；在雪蓮果浸膏和陽性藥物的治療下，雪蓮果高、中劑量組和陽性對照組的胰脂肪酶、輔脂酶蛋白表達相比于模型組有所降低(P<0.05)，見圖4。提示雪蓮浸膏對較好的降脂作用。

注： (1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。

3 討論

目前，人們對高脂血癥藥物的研發，主要從調控外源性脂質吸收、內源性脂質合成與膽汁酸重吸收、血漿脂蛋白代謝以及脂質代謝等方面進行[11-13]。本文基于KEGG與GO的注釋進行富集分析，其中GO富集分析包含BP、CC、MF三個層面。KEGG富集分析中，膽固醇代謝、PPAR信號通路以及脂肪的消化和吸收等信號通路被顯著富集；在GO富集分析中脂質分解代謝、類固醇分解代謝以及脂質分解代謝調控等生物過程，膽固醇轉移活性、羧酸酯水解酶活性以及甾醇轉移活性等分子功能被顯著富集，據此推測，脂質、類固醇和膽固醇代謝可能是雪蓮果治療高脂血癥的重要機制。膽汁轉換脂肪酶、載脂蛋白A以及載脂蛋白B等參與了上述過程。膽汁轉換脂肪酶即胰脂酶(lipase)，包括胰脂肪酶、輔脂酶，在外源性脂質吸收過程中胰脂肪酶、輔脂酶起著關鍵的作用，其能夠影響 PLA2G7, PLA2G1B等靶點參與體內脂質吸收和調節體內膽固醇的代謝，進而影響高脂血癥的發生發展，可能作為關鍵靶點發揮抗高脂血癥的作用，故本實驗從胰脂肪酶、輔脂酶出發，探究雪蓮果浸膏影響大鼠脂質吸收的生物化學機制。

胰脂肪酶是一種脂肪代謝的重要酶類，于胰腺合成，可水解百分之五十到百分之七十的食物脂肪[14]。小腸表面張力升高，使胰脂肪酶不能與微團內的三酰甘油接觸，此外，在水油界面，胰脂肪酶易變性失活[15]。輔脂酶在胰腺腺泡合成，只有輔脂酶才能使胰脂肪酶固定于微團的水油面上，并可防止其變性，增加其活性，促進脂肪水解[16]。因此，輔脂酶是胰脂肪酶作用的必需因子[17]。本實驗中的奧利司他是一種在臨床上比較認可的減肥藥，具有非常高的安全性，它主要是特異性的胃腸道脂肪酶抑制劑，能夠阻斷人體對脂肪的吸收，因此采用其作為在本實驗中作為陽性對照組。

雪蓮果(smallanthus sonchifolius)，俗名yacon，又稱亞貢、亞龍果，盛產于貴州，是一種低熱食品和藥食同源型水果，富含多種人體必須氨基酸、礦物質和可溶性的纖維。研究發現，雪蓮果除了可藥用外，還具有多種功效，如降血脂、降血糖、護肝、抑菌、抗氧化等[18-19]。朱振元等[20]發現雪蓮果中糖類成分對高脂飲食所致小鼠血脂升高有明顯抑制作用，能有效預防高血脂癥。聶蘭等[21]發現一定劑量的雪蓮果汁能上調大鼠肝臟組織中 AMPK mRNA 和蛋白質表達，下調 ACC mRNA和蛋白質表達，從而抑制脂肪酸合成，同時加速脂肪酸氧化，達到降脂作用。但目前為止對于雪蓮果如何糾正血脂異常的具體作用機制仍沒有明確的結論,待進一步研究考證。

本研究結果顯示，各組大鼠體重增減量之間雖存在變化，但是其差異不具備統計學意義，說明雪蓮果浸膏對大鼠體重影響不顯著；血清學層面，雪蓮果浸膏干預后，高、中劑量的雪蓮果浸膏能顯著降低大鼠血清中TG、TC和LDL-C水平，中劑量組對HDL-C的升高效果則更好；蛋白和基因層面，雪蓮果浸膏高、中劑量組大鼠胰脂肪酶、輔脂酶的蛋白和mRNA的表達水平較陰性對照組均降低，與陽性藥物奧利司他作用效果趨勢基本一致，表明雪蓮果浸膏能抑制胰脂肪酶蛋白的表達及基因的轉錄，從而達到有效降脂作用。

根據預測和實驗結果，推測雪蓮果浸膏治療高脂血癥的可能作用機制為直接或間接調節影響脂肪代謝的關鍵靶點，減少腸道脂質吸收，調節脂質代謝平衡，從而減少內臟脂肪沉積，且結果表明其降脂效果呈現一定的劑量依賴性，可能的作用途徑為：在一定劑量下，雪蓮果浸膏可通過抑制胰脂肪酶、輔脂酶的基因轉錄，從而抑制大鼠胰腺中的胰脂肪酶、輔脂酶的蛋白合成，直接導致從胰腺進入腸道的胰脂肪酶、輔脂酶含量減少，無法促進脂肪(主要是甘油三酯)及其分解代謝產物(游離脂肪酸和單酰基甘油)的消化吸收，從而減少了大鼠腸道對小分子脂質的吸收，對脂肪的合成、轉運起到一定的抑制作用。Papapanagiotou等[22]研究發現，高脂血癥除了涉及脂質代謝紊亂外，其發生發展以及并發癥常伴有炎癥和內皮功能障礙；Mylonis 等[23]研究發現，缺氧也可以增強脂肪的生成過程，主要是因為涉及脂肪酸(FA)攝取、合成和儲存等過程；研究表明，PI3K/Akt 與 FoxO信號通路也協同作用于糖脂代謝，其中 PI3K-Akt 信號通路可調節葡萄糖穩態，脂質代謝等過程，FoxO亞家族可通過介導胰島素或類胰島素生長因子對細胞生長分化、氧化應激、自噬及衰老起到抑制作用[24]；另外，雖然朱振元等[20]研究發現雪蓮果多糖成分能抑制糖尿病小鼠餐后血糖升高和顯著增強糖尿病小鼠葡萄糖的負荷糖耐量，并具有一定預防高脂血癥的效果，但是其能否通過抑制炎癥因子來發揮抗動脈粥樣硬化等慢性病，能否通過緩解胰島素抵抗來達到降低血糖的目的，還有待進一步驗證。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法挖掘雪蓮果治療高脂血癥的活性成分，通過網絡構建及通路富集闡述了活性成分與作用靶點和通路之間的聯系，雪蓮果有效成分能通過影響脂質、類固醇和膽固醇代謝等過程，調節PPAR、脂肪的消化吸收等信號通路延緩高脂血癥的發生發展。同時，本研究揭示了雪蓮果浸膏治療高血脂癥的潛在分子機制，證實了網絡藥理學預測結果，雪蓮果浸膏通過作用于胰脂肪酶和輔脂酶關鍵靶點，影響腸道的脂質吸收過程從而發揮降脂作用，而此分析結果與目前臨床治療脂代謝異常的其他藥物較為一致，奧利司他是一種非全身作用的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，主要通過作用于胃腸系統的胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵，導致脂肪酶失活，從而抑制甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油[25]，這與本項目雪蓮果的腸道作用機制相一致，而雪蓮果究竟是否能通過提高胰高血糖素、胰島素降解酶含量促進糖脂代謝過程，還有待進一步驗證。本實驗結果不僅揭示了雪蓮果通過多成分、多靶點、多途徑整體調節脂質代謝的特點，也為進一步深入探討其降脂作用機制奠定了基礎，還為其是否能通過抗氧化、降血糖、抗動脈粥樣硬化等與高脂血癥密切相關的作用機制提供了指導方向，為該方臨床應用及深入研究提供了理論依據。