桔梗皂苷D治療肥胖的潛在作用機制研究*

王賢， 鐘沁， 劉芳， 韋睿然， 桂黎明*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫學教研室, 貴州 貴陽 550000； 2.安徽醫科大學 臨床醫學院 基礎醫學部, 安徽 合肥 230031)

肥胖是一類慢性代謝性疾病，與許多疾病密切相關，包括脂代謝紊亂、胰島素抵抗、2 型糖尿病、肝膽疾病、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病等[1-6]。世界肥胖問題工作小組采用身體質量指數(body mass index,BMI)作為超重與肥胖的判定標準[7]，BMI ≥28 kg/m2時，即可判定為肥胖，肥胖的患病率正呈現逐年上升趨勢，已經成為世界健康問題之一。據估計，未來 20 年肥胖仍會持續增長[8]，因此解決并改善肥胖問題刻不容緩。目前，主要通過飲食運動療法、抗肥胖藥物、外科手段減輕肥胖，但效果均不理想[9-12]。桔梗皂苷 D (platycodin D，PD)是從傳統中藥桔梗里提取的一種三萜類單體的皂苷成分，在桔梗里含量相對較高且為其主要生物活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤、增強免疫等多種藥理作用[13-14]。相關研究表明，PD 能抑制胰脂肪酶活性，從而抑制腸道對食物脂肪的吸收[15]；動物實驗表明，PD 通過調節脂肪生成和產熱來減輕 db/db 小鼠的肥胖[16]。小鼠成纖維 3T3-L1細胞是一種特征明確的前脂肪細胞，具有從前體細胞分化為成熟脂肪細胞的潛力[17]，是體外研究脂肪酸代謝和肥胖的成熟細胞模型[18-21]。本研究運用網絡藥理學與分子對接技術預測PD 干預肥胖的分子靶點與潛在作用機制，并通過體外實驗初步驗證PD 抑制 3T3-L1 前脂肪細胞分化的作用機制，觀察促進白色脂肪細胞生成的關鍵基因-固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-1c)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)的mRNA和蛋白的表達水平[22-24]，為肥胖治療的研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 小鼠成纖維 3T3-L1 前脂肪細胞株來自于中國科學院干細胞庫(SCSP- 5038)。

1.1.2藥物 PD粉末純度98.34%(MCE, HY-N1411)，使用 DMSO配制成 10 mmol/L 的母液備用。

1.1.3主要試劑與儀器 DMEM 高糖培養基(GIBCO, 美國)，新生小牛血清(Ausbian，澳大利亞)，胎牛血清(Vistech, 丹麥)，青/鏈霉素、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺(GIBCO, 美國)，Dexamethasone、IBMX、Rosiglitazone(Sigma-Aldrich，美國)，Insulin(Solarbio，中國)，CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒(Biosharp，中國)，油紅 O 染色試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒(Solarbio，中國)，RNA 快速提取試劑盒、快速逆轉錄試劑盒、2×Super SYBR qPCR Master MIX(ES science，中國)，一抗蛋白(SREBP-1c、FAS)、二抗蛋白(Affinity，中國)。多功能酶標儀(Bio-tek，美國)，倒置熒光顯微鏡(Leica，德國)，實時熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，美國)，蛋白化學發光成像系統(Bio-Rad，美國)。

1.2 網絡藥理學與分子對接分析

1.2.1藥物靶點預測 通過 Pubchem 數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取PD 的 Smiles 結構式，文件以 SDF 格式保存并導入 Swiss Target Prediction 數據庫(http://www.swisstarget-prediction.ch/index.php)進行活性成分的靶點預測，以“小鼠”為研究物種收集靶點，去除重復項，整理這些靶點的蛋白名稱、基因名稱及 UniPort ID 等信息。

1.2.2肥胖的靶點預測 在 Gene Cards 數據庫(http://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、TTD 數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)中輸入關鍵詞 “obesity” 作為檢索條件，并將篩選條件設置為score≥20，收集并整理 3 個數據庫共同收錄的肥胖相關疾病靶點。

1.2.3PD與肥胖的共同靶點篩選 將獲取的藥物與疾病相關靶點輸入微生信在線平臺，獲得兩者靶點蛋白交集的維恩圖。

1.2.4蛋白相互作用(PPI)網絡構建 采用 STING 數據庫(https://stringdb.org/cgi/input.pl)對獲取的藥物—疾病靶點進行分析[25]，本研究設定最小互作分數值≥0.7，篩選潛在作用核心靶點，并應用 Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化處理。

1.2.5GO功能與KEGG富集分析 通過 R軟件(https://www.rproject.org)對藥物與疾病相關靶點進行 基因本體分析(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析[26]。基因名稱選擇為“OFFICE_GENE_SYMBOL”，選擇 GO 功能中的生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular functions，MF)和細胞組分(cellular components，CC)3 個參數對基因進行富集；使用 R 語言進行 KEGG 通路富集分析，根據調整后的P值(P<0.05)進行排序。通過微生信進行數據可視化處理，得到條形圖及氣泡圖。

1.2.6藥物-靶點-通路可視化網絡構建 將藥物與疾病共同基因數據導入 Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org)軟件構建藥物-靶點-疾病網絡圖，以網絡 degree、betweenness centrality和 Closeness 為篩選條件，挖掘網絡核心節點。

1.2.7分子對接 在 Pubchem 數據庫下載PD活性成分的 2D 結構圖，通過 PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點的配體結構，使用 Autodock Vina 對接每個成分和配體，獲取結合能最高的位點，最后使用 PyMol 軟件(https://pymol.org/)對對接結果進行可視化分析。根據相關文獻可知，結合能≤-5.0 kcal/mol的對接分數表明該化合物與靶點之間具有良好的結合活性，且結合能越小代表二者間結合的活性越好。

1.3 細胞實驗

1.3.1細胞培養 3T3-L1前脂肪細胞在 37 ℃、5% CO2的培養箱中用完全培養基(高糖DMEM培養基+10%新生小牛血清+1%青鏈霉素+1%丙酮酸鈉+1%非必需氨基酸+1% L-谷氨酰胺)進行常規傳代培養。

1.3.2細胞增殖實驗(CCK-8)法測定細胞存活率 收集對數生長期的 3T3-L1細胞，按 1×104個細胞/孔接種于 96 孔板，待細胞生長狀態良好時，第2天加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD，每個濃度設置 6 個復孔，另設對照組(不加 PD)與空白組(僅含培養基，不含 PD，不接種細胞)，分別處理24、48及72 h，取CCK-8溶液10 μL加到96孔板，溫育2 h ，采用多功能酶標儀檢測450 nm 波長處細胞吸光度值(optical density, OD)。

1.3.3細胞凋亡率 采用流式細胞術檢測，將細胞以1×106個細胞/孔接種于6 孔板后放置培養箱中培養，待細胞生長狀態良好時，加入5、10、20、40、60及80 μmol/L PD分別處理 24、48及72 h；取胰酶100 μL消化貼壁細胞，加入 1 mL 培養基終止消化并吹打均勻，細胞懸液收集至EP 管中，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清；加入 PBS 重懸 1 次，去離子水按照1 ∶3稀釋結合緩沖液，用1×Binding buffer 重新懸浮細胞，調節濃度為1×109個細胞/L；取細胞懸液100 μL 加入5 mL 的流式管，加入 Annexin V- Alexa flour647 染液5 μL，混勻后室溫避光培養5 min，再加入20 mg/L PI 染液10 μL，加入 PBS 400 μL，立刻進行流式檢測，收集數據并分析。

1.3.43T3-L1前脂肪細胞的誘導分化 取對數生長期的 3T3-L1細胞以1×106個細胞/孔接種于6孔板，待細胞生長融合至80%時，根據 Zebisch 等[24]的實驗方法對細胞進行誘導分化，先將1 mg/L Insulin、0.5 mmol/L IBMX、0.25 μmol/L Dexamethasone 及2 μmol/L Rosiglitazone 同時加入高糖 DMEM培養液(含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素)中誘導3T3-L1細胞 48 h，再用僅含1 mg/L Insulin 的培養液繼續誘導48 h，最后換用不添加任何誘導成分的培養基繼續培養細胞，直至鏡下出現脂滴。在分別給予5、10及20 μmol/L PD處理細胞，并設對照組(不加PD)。收集誘導完成后的細胞，采用油紅O染色檢測 PD細胞中脂滴的積累情況，采用實時熒光定量PCR (RT-qPCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)實驗檢測不同濃度 PD 對SREBP-1c、FAS的 mRNA 及蛋白表達的影響。

1.3.5油紅O染色 去除培養基、PBS 洗滌、固定液固定細胞 25 min、去除固定液，使用雙蒸水洗滌 2 次，加入 60% 異丙醇浸洗 5 min，棄去異丙醇后直接加入新鮮配制好的油紅 O 染色工作液，浸染 30 min；染色完畢后，雙蒸水洗滌 5 次，每孔加入雙蒸水覆蓋細胞，倒置顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.3.6RT-qRCR 檢測SREBP-1c、FASmRNA表達 使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，同時測定RNA純度與濃度，隨后將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件為設定為42 ℃ 15 min; 最后使用2× Super SYBR green qPCR Master Mix進行實時熒光定量PCR檢測，條件設定為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 共40個循環。采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對表達量。SREBP-1c 上游引物序列為5′- GACGAC-GGAGCCATGGATT -3′，下游引物序列為 5′-CAGCAGTGAGTCTGCCTT-GAT -3′, 目的片段672 bp；FAS 上游引物序列為5′- GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT-3′，下游引物序列為 5′- TGGG-TAATCCATAGAGCCCAG -3′，目的片段140 bp；內參照β-actin 上游引物序列為5′- CATGTACGTTGCT-ATCCAGGC -3′，下游引物序列為5′- CTCCTTAATGTCACGCACG-AT -3′, 目的片段250 bp。

1.3.7Western blot 檢測 SREBP-1c、FAS 蛋白表達 使用RIPA裂解液(含1% PMSF)裂解細胞提取總蛋白，BCA 蛋白濃度檢測定量各組總蛋白濃度;采用10%的 SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，隨后轉印至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉 1 h，TBST洗滌后，SREBP-1c、FAS蛋白一抗(1 ∶1 000)4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗滌后，二抗(1 ∶3 000)室溫孵育 1.5 h，TBST 洗滌后，ECL 顯影后應用 Image Lab 軟件分析條帶的灰度值。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 網絡藥理學與分子對接分析

2.1.1PD潛在作用靶點篩選 通過 STD、HERB、SuperPred PharmMapper、SwissTargrtPrediction、SEA 數據庫進行靶點預測，共找到 539 個靶點，使用 UniProt 數據庫規范命名并排除重復靶點，共獲得 438 個靶點。

2.1.2肥胖潛在靶點獲取 在 TTD、 GeneCards、OMIM 數據庫搜索與肥胖相關的靶點，合并去除重復后共得到 1 104 個疾病靶點。

2.1.3PD與肥胖交集靶點 將獲得的PD靶點與肥胖疾病靶點上傳微生信在線平臺，靶點合并取交集得到維恩圖，獲得 131 個交集靶點(圖1)。

圖1 藥物與肥胖共同靶點韋恩圖

2.1.4PPI網絡的構建及核心蛋白的篩選 將藥物與疾病的131個共同靶點導入STRING 數據庫得到 txt 文本文件，隨后將文本導入 Cytoscape 3.7.2 軟件進行分析和可視化處理(圖2)，網絡拓撲分析顯示，PPI網絡共含有124個節點，1 794條邊。采用 Cytohubba 插件中的MCC算法，根據度值共獲得10個核心靶點基因，包括包括蛋白激酶B α(protein kinase B α,AKT1)、信號轉導和轉錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)、腫瘤蛋白53(tumor protein p53,TP53)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)白介素6(Interleukin-6,IL6)等(表1)。

圖2 PD治療肥胖的“藥物-靶點-通路”網絡圖

表1 PD治療肥胖的潛在核心靶點

2.1.5PD對肥胖作用靶點的生物學分析 使用R軟件對PD對肥胖作用靶點基因進行GO功能富集分析，共獲得2 614個GO條目(P<0.05)，分別選取BP、CC MF的Count值排名前十的條目(圖3)。BP條目有2 444個，其中包括營養水平反應(response to nutrient levels)、細胞對氧化應激的反應(cellular response to oxidative stress)、肌肉細胞增殖(muscle cell proliferation)、類固醇激素反應(response to steroid hormone)及脂多糖反應(response to lipopolysaccharide)等； CC條目有 27 個，其中包括細胞質膜(membrane raft)、常染色質(euchromatin)、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物(RNA polymerase Ⅱ transcription regulator complex)、轉錄調節復合物(transcription regulator complex)及微膜區(membrane microdomain)等； MF條目有 143 個，包括核受體活性(nuclear receptor activity)、類固醇結合(steroid binding)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA binding transcription factor binding)及轉錄共調節子結合(transcription coregulator binding)等。根據P<0.05 進行 KEGG 通路富集，共獲得 154 條相關通路，選取P值排名靠前的 20 條通路利用微生信制作氣泡圖(圖4)，得到PD 治療肥胖的主要信號通路包括酒精性肝病(alcoholic liver disease)、胰島素抵抗(insulin resistance)、AMPK 信號通路(AMPK signaling pathway)(圖5)、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、HIF-1 信號通路(HIF-1 signaling pathway)、脂肪細胞因子信號通路(adipocytokine signaling pathway)及AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway)等。

圖3 PD治療肥胖核心靶點的 GO 功能富集分析

圖4 KEGG 功能富集分析

圖5 PD治療肥胖癥作用的 AMPK 信號通路

2.1.6PD-肥胖靶點-通路網絡構建 將PD和肥胖癥共同靶點導入 Cytoscape 3.7.2 軟件，獲得P D-靶點-肥胖網絡(圖6)，該網絡共有 152 個節點、560 條邊。

注：圖中深灰色代表PD，其他代表PD 的相關靶點及信號通路，邊代表兩者之間的關系。

2.1.7分子對接結果分析 為了從分子水平闡明PD 與關鍵白蛋靶點 AMPK、SREBP1c、FAS 的作用模式，通過Autodock軟件進行分子對接，結合能見表 2，由此可知蛋白與化合物對接相互作用的結合能在 -10.2～-8.8 kcal/mol，提示本實驗的數據與結果較為可靠，具有較高的參考價值。圖7為PD與肥胖核心靶點的分子對接模式圖。

表2 PD 與關鍵蛋白靶點結合能

注：A、B、C依次為 AMPK、SREBP-1c、FAS 對接結果。

2.2 細胞實驗

2.2.13T3-L1前脂肪細胞存活率 CCK-8結果顯示(圖 8)，使用不同濃度 PD 處理3T3-L1前脂肪細胞 24、48及72 h，PD<20 μmol/L對細胞無明顯毒副作用(細胞存活率均在90% 以上)；PD>20 μmol/L細胞毒作用明顯增強，細胞存活率明顯降低 (P<0.001)，表明 PD 抑制細胞增殖作用呈濃度依賴性。因此，選擇 20 μmol/L PD作為最大給藥濃度，后續實驗在該濃度范圍內進行。

注：(1)與對照組相比，P<0.001。

2.2.2PD對3T3-L1細胞凋亡的影響 收集培養24、48及72 h 的細胞進行凋亡檢測，結果顯示：與對照組相比， 5、10及20 μmol/L PD 分別連續培養72 h，3T3-L1前脂肪細胞始終能夠保持較高的細胞活性，未發生明顯的細胞凋亡(圖9)。

注：A 為凋亡率流式圖，B 為凋亡率線形圖；(1)與同時點對照組相比，P<0.01。

2.2.3PD對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 結果顯示：對照組3T3-L1前脂肪細胞在誘導分化后出現大量脂滴；在5、10及20 μmol/L PD處理細胞后，細胞內也出現數量不等的脂滴，并且隨著PD濃度的增加，脂滴數量逐漸減少，其中，20 μmol/L組中的脂滴含量最少，與對照組的脂滴含量相比，差異有統計學意義(P<0.001)。提示PD 呈濃度效應抑制3T3-L1前脂肪細胞分化(圖10)。

圖10 不同濃度 PD 對 3T3-L1 前脂肪細胞分化影響

2.2.4不同濃度PD對SREBP-1c和FASmRNA表達的影響SREBP-1c和FAS是促進白色脂肪細胞生成的關鍵基因，因此，實驗進一步探討PD抑制3T3-L1細胞分化過程中這兩種基因的表達情況。RT-qPCR 結果顯示(圖 11)，與對照組比較，PD各濃度組的SREBP-1c、FASmRNA表達量均出現不同程度的下調(P<0.01)，且SREBP-1c、FASmRNA表達量隨著PD濃度的增加而逐漸減低，其中PD為20 μmol/L時降低最為顯著。提示 PD 在脂肪細胞分化過程中，能夠通過調控細胞中SREBP-1c、FASmRNA表達量來抑制3T3-L1細胞分化成為成熟脂肪細胞。

注：(1)與對照組相比，P<0.01。

2.2.5不同濃度PD對SREBP-1c與FAS蛋白表達的影響 Western blot結果顯示(圖 12)，與對照組比較，SREBP-1c、FAS蛋白表達量隨著PD濃度的升高呈現不同程度的下調，并且與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。提示PD在脂肪細胞分化過程中，能夠通過下調細胞中SREBP-1c、FAS蛋白表達進而抑制3T3-L1細胞分化。

注：(1)與對照組相比，P<0.01。

3 討論

肥胖的發生和發展是一個復雜且涉及多通路的過程，各因子與因子之間、因子與通路之間形成一個相互影響、聯系緊密的網絡結構。目前，抗肥胖治療并不樂觀，但隨著中草藥研究的進展，這一情況正逐漸得到改善。中藥療法注重整體觀和辨證論治原則，根據不同時期癥型選擇選擇不同治療方法，標本兼治，且中藥藥性溫和，相對安全。中藥因其本身含有多種活性成分，毒效應小，具有多效應、多靶點及多通路途徑協同調節的優勢。桔梗是我國傳統重要的藥用資源之一，桔梗屬于桔梗科植物Grandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根[27]，含有多種活性成分與較高的生物活性，其本身具有利咽、祛痰、抗炎、降糖及提高免疫力等功能，廣泛用于癌癥、哮喘、炎癥及糖尿病腎病等方面的治療與研究[28-29]。相關研究表明，桔梗的活性組成部分桔梗總皂甙具有抑制胰脂肪酶活性作用[30]。

在本研究中，利用網絡藥理學探討桔梗的主要活性成分PD 對肥胖的分子靶點及潛在作用機制，通過分子對接進行驗證。維恩圖交集結果顯示PD 對肥胖可能起到作用的靶點共131個，推測PD 是通過多個靶點發揮治療肥胖作用的。PPI 網絡結果分析可知，AKT1、EGFR、VEGFA、TP53、STAT3 靶點的自由度值較高，推測這些核心靶點可能在抗肥胖治療中起到關鍵作用。AKT1 是胰島素樣生長因子 1 受體在脂肪細胞克隆擴增后分化過程中重要的信號分子，在調節糖脂代謝方面具有重要作用[31]。TNF 和 IL6 是重要的免疫炎癥調節因子，促炎因子的表達與肥胖造成的一系列免疫不良反應密切相關，TNF-α 會阻礙胰島素信號轉導，而 IL6 具有加重胰島素抵抗的作用[32]。GO 與 KEGG 生物學分析結果表明，PD 可通過多個靶點、多條通路影響肥胖的發生與發展。糖脂代謝相關通路與肥胖密切相關，其中，AMPK 信號通路是調控脂質代謝關鍵的通路之一，AMP依賴的蛋白激酶磷酸化后通過下調其下游脂肪生成相關基因，如 SREBP-1c、FAS 等，從而降低肥胖的發生[33]。此外PD與胰島素抵抗信號通路、脂肪因子信號通路、AGE-RAGE 信號通路等與糖脂代謝相關的通路均具有聯系。分子對接結果顯示，PD 與 AMPK 的結合活性最好(-10.2 kcal/mol)，隨后是與 FAS(-9.0 kcal/mol)、SREBP-1c(-8.8 kcal/mol)，由對接模型初步驗證PD 可能通過 AMPK 信號通路發揮抗肥胖作用機制。

與肥胖關系最密切的是體內脂肪組織。脂肪組織是機體的能量儲存器官，也是機體重要的內分泌器官，能夠分泌多種細胞因子。正常情況下，脂肪組織具有產熱、體溫維持、內分泌及支持等功能，有利于身體的能量平衡。目前，哺乳動物體內的脂肪組織按形態特征可分為白色脂肪組織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織。白色脂肪組織內的白色脂肪細胞是其主要的細胞類型，是機體主要的脂肪庫。棕色脂肪組織內含豐富的線粒體，為機體重要的適應性產熱器官。米色脂肪組織是二者之間轉化過度的中間體，功能類似于棕色脂肪組織。SREBP-1 是白色脂肪組織產脂基因表達的主要轉錄因子，SREBP-1c 是主要亞型，在肝臟和白色脂肪細胞中表達，通過激活甘油三酯合成基因進而促進脂肪的生成[34]。FAS 是介導白色脂肪細胞內甘油三酯合成過程中的關鍵蛋白，催化脂肪從頭合成。相關實驗研究表明，脂肪組織中 FAS 的表達量與甘油三酯和脂肪合成呈正相關，且 FAS 出現在細胞分化為成熟脂肪過程的中、后期，其下調能減少脂滴的生成[35]。本實驗研究發現，PD 在20 μmmol/L 安全范圍內能夠下調細胞中SREBP-1c、FAS 的表達，抑制脂肪細胞脂滴生成，并且具有濃度效應。

綜上所述，本研究從網絡藥理學與分子對接角度上闡述了PD 對肥胖的分子靶點及潛在作用機制，體外實驗結果表明，PD 可抑制前脂肪細胞3T3-L1分化為成熟脂肪細胞，其機制與下調脂肪生成關鍵因子 SREBP-1c、FAS 的表達有關，但 PD 抑制脂肪生成相關蛋白信號通路仍需后續實驗進一步證實。