辛伐他汀對老年糖尿病認知功能障礙大鼠腦組織Klotho蛋白表達影響及其相關研究*

竇易銘，王紅杰，白 潔，朱 澤，李光明△

(1.天津醫科大學基礎醫學院 300070;2.天津市東麗醫院內分泌科 300300；3.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院內分泌科 150000)

糖尿病是一種多因素代謝紊亂疾病，并伴有包括中樞神經系統功能障礙的多種器官功能障礙[1]。伴隨年齡增加，老年糖尿病患者發生認知功能障礙的風險增大，年齡≥60歲的患有認知功能障礙或輕度認知功能障礙的患者中，約有50%患者為有糖尿病前期或患有糖尿病[2]。Klotho是一種可以在神經系統中表達的抗衰老蛋白，具有阻止多種神經退行性疾病發展的作用[3-4]。辛伐他汀是一種親脂性他汀，可以增強Klotho的表達[5]。在本次實驗中，筆者對已經發生糖尿病相關的認知功能障礙的老年大鼠，長期使用辛伐他汀，測定其腦內Klotho蛋白表達、神經元凋亡及認知功能的改變等，探究其相關病理生理機制，為臨床藥物使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次實驗選擇18～22月齡老年SD大鼠(18～22月齡)，分為4組，分別為對照組：大鼠給予正常飼料飲食，于第12周開始口服灌胃生理鹽水8周；模型組：大鼠給予高脂飲食12周，于第4周開始腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg 8周，于第12周開始灌胃生理鹽水8周；辛伐他丁組：大鼠給予正常飼料飲食，于第12周開始口服灌胃辛伐他丁10 mg·kg-1·d-1，持續8周；糖尿病+辛伐他丁組：大鼠給予高脂飲食在建立糖尿病認知功能減退(diabetes-associated cognitive decline，DACD)模型成功的基礎上，于第12周開始口服灌胃辛伐他丁10 mg·kg-1·d-1，持續8周。每組12只，干預前體重450～550 g，購自北京維通利華實驗動物公司。所有實驗動物均飼養于恒溫(23±3)℃、恒濕，明暗周期固定(12 h/12 h)、可自由獲取食水的環境中。

1.2 老年DACD大鼠模型構建

根據參考文獻[6]，對糖尿病組老年大鼠全程給予高脂飲食(45 kcal%脂肪，購自美國Research Diets公司)12周，實驗開始前剔除血糖低于1.5 mg/mL的大鼠，同時于第4周腹腔注射25 mg/kg STZ，8周后取大鼠尾靜脈血利用Accu-Chek血糖儀(德國Roche Diagnostic公司)進行空腹血糖檢測，≥2.5 mg/mL表明糖尿病模型建立成功。普通大鼠給予正常飼料，于第4周腹腔注射0.1 mol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.2)，持續8周。糖尿病大鼠連續檢測血糖4次，均空腹血糖≥2.5 mg/mL，且Morris水迷宮實驗逃避潛伏期和穿越平臺次數與對照組大鼠比較差異有統計學意義(P<0.05)，則判斷為大鼠造模成功。

1.3 Morris 水迷宮實驗

水迷宮的圓形水池直徑180 cm，高45 cm，充水至30 cm的深度，水溫在(25±1)℃，并在25 cm的高度安裝直徑為12 cm的平臺。使用兩個垂直線程將池劃分為4個相等的象限。實驗第1天，大鼠在水池中自由游泳2 min。在第2～5天進行了空間訓練測試，單次時間2 min，并在每天固定的2個時間點在4個不同的象限中重復數次。在整個實驗期間，平臺的位置保持不變。使用計算機記錄老鼠被放入水中直至發現并爬上透明平臺所需要的時間，即為逃逸潛伏期。在第5天，撤去平臺，進行空間探索實驗，記錄從對側象限向到平臺所需所的時間和經過平臺的次數。

1.4 Neun免疫熒光染色

取各實驗組大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉(20 mg/g)麻醉后，斷頸處死，生理鹽水灌流，取海馬組織，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水48 h后，冰凍切片，進行免疫熒光染色。0.3% Triton-100室溫孵育30 min，10%羊血清封閉，室溫孵育2～3 h。兔抗鼠一抗Neun(1∶1 000，美國Abcam)4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗(1∶1 000，美國Abcam)室溫孵育2 h。熒光顯微鏡觀察，計算各組大鼠海馬CA1區Neun光密度，隨機取4個視野的光密度，計算平均值。

1.5 Western blot 檢測Klotho、Caspase-3蛋白表達變化

取各實驗組大鼠腦海馬組織，利用RIPA裂解液(索萊寶，中國)提取總蛋白，利用BCA試劑盒(索萊寶，中國)定量蛋白濃度,然后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將電泳分離的蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂牛奶常溫封閉2 h，加入Klotho、caspase-3蛋白一抗(1∶800，美國Abcam),4 ℃孵育過夜;加入過氧化物酶標記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h,顯影、定影,用凝膠軟件分析各組蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參計算蛋白表達水平。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 DACD模型大鼠篩選

與對照組比較，模型組大鼠空腹血糖升高，Morris 水迷宮實驗逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1、2。

表1 對照組和模型組老年大鼠空腹血糖結果比較

表2 對照組與模型組大鼠水迷宮實驗結果比較

2.2 辛伐他汀對糖尿病認知功能的影響

與對照組比較，辛伐他汀組逃避潛伏期(t=1.736，P=0.113)、穿越平臺次數(t=0.553，P=0.593),差異均無統計學意義，模型組大鼠逃避潛伏期延長((t=9.946，P<0.05)、穿越平臺次數減少(t=11.35，P<0.05)，差異有統計學意義，糖尿病+辛伐他汀組組逃避潛伏期延長(t=5.458，P<0.05)、穿越平臺次數減少(t=5.409，P<0.05)，差異有統計學意義；與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組組大鼠逃避潛伏期時間縮短(t= 3.467，P<0.05)、穿越平臺次數增加(t=5.926，P<0.05)，差異有統計學意義。見表3。

表3 4組大鼠使用辛伐他汀后水迷宮實驗結果比較

2.3 Klotho、Caspase-3蛋白在各組間表達變化

與對照組比較，模型組和糖尿病+辛伐他汀組大鼠Klotho蛋白表達水平均減少(t=11.602，P<0.05；t=9.032，P<0.05)；Caspase-3蛋白水平表達上升(t=13.585,P<0.05;t=4.307，P<0.05)，差異有統計學意義；與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠Klotho蛋白表達水平增加(t=3.094,P<0.05);Caspase-3蛋白表達水平下降(t=3.847,P<0.05)，差異有統計學意義。見圖1。

A：Western blot；B：Western blot定量分析；a:P<0.05，b：P<0.001。

2.4 各組Neun免疫熒光染色變化

與對照組比較，模型組和糖尿病+辛伐他汀組的大鼠Neun光密度下降，差異有統計學意義(t=8.172，P<0.05;t=5.012，P<0.05)；與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠Neun光密度增加，差異有統計學意義(t=3.961，P<0.05)。見圖2。

A:大鼠海馬CA1區Neun蛋白免疫熒光染色；B：免疫熒光染色光密度定量分析；a:P<0.05，b：P<0.001。

3 討 論

糖尿病是目前常見的內分泌系統疾病，其并發癥涉及多系統，伴隨心臟、血管、腎臟、神經等多種器官功能障礙[2]。持續的高血糖引發糖尿病患者微血管病變，是導致認知功能障礙，糖尿病腎病、視網膜病變等眾多并發癥的主要病理機制之一[7]。伴隨人口老齡化，老年糖尿病患者數量逐年升高[8]。流行病學調查顯示[8]，在年齡和高血糖因素的共同作用下，老年糖尿病患者的神經系統功能障礙及癡呆的發生率與健康老年人群相比明顯增加。由于糖尿病患者的認知功能障礙早期癥狀較為隱蔽，在確診時已經出現較為嚴重的癡呆表現，嚴重影響患者的生存質量。因此對于如何延緩已經發生認知功能障礙的老年糖尿病患者的病情加重，合理使用藥物，提高老年糖尿病患者的生存質量，逐漸成為近年來的研究熱點。

本實驗中使用DACD模型，該模型是一類糖尿病相關的血管性癡呆模型[9-11]，將老齡化與高血糖2個與血管相關的危險因素結合[12]，更符合目前臨床實際狀況，有利于探究其相關機制。實驗結果顯示，與對照組比較，使用模型組大鼠血糖水平明顯升高，且在造模后8周內，血糖水平均高于250 mL/dL，符合糖尿病的判斷標準[13]。Morris水迷宮主要用于測試實驗動物在空間記憶方面的能力[14]。在本次水迷宮實驗中，與對照組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數明顯下降，說明老年糖尿病大鼠的空間記憶能力損傷更為明顯，認知功能下降。

辛伐他汀作為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑，可以阻斷膽固醇的合成，是一類高效的降血脂藥，對高膽固醇血癥、冠心病等有明顯的療效[15-16]；同時辛伐他汀具有多種非調脂類作用，抗氧化、抗炎作用，改善內皮損傷等，可以減少高血糖、高血脂造成的氧化損傷、減少炎性因子對血腦屏障的損傷、減少微血管內皮損傷等血管相關損傷，且可以跨越血腦屏障，緩解部分腦血管疾病的進展[15,17-19]。目前，針對已經發生認知功能障礙的老年糖尿病大鼠，辛伐他汀是否仍可以緩解其血管性癡呆的進程尚未有報道，機制尚待明確。本次實驗對老年糖尿病認知功能障礙大鼠和同年齡老年大鼠均使用辛伐他汀，以觀察辛伐他汀對已經產生認知損傷的大鼠的影響。實驗中利用水迷宮實驗觀察各個實驗組大鼠的認知功能改變情況，結果顯示，與對照組比較，模型組和糖尿病+辛伐他汀組大鼠的均表現為逃避潛伏期延長，穿越平臺次數明顯減少，認知功能損傷的狀態；但與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數明顯增加，空間記憶能力損傷減輕，表明辛伐他汀在一定程度上阻止了糖尿病引發的認知功能損傷持續加重。在神經元細胞層面，利用Neun的熒光染色結果觀察神經損傷程度[20]，與對照組比較，模型組與糖尿病+辛伐他汀組大鼠，神經元損傷均加重；但與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠認知功能損傷程度緩解。Caspase-3作為細胞凋亡的相關蛋白[21]，通過監測其在各組的表達水平發現，與對照組比較，模型組與糖尿病+辛伐他汀組大鼠海馬區的Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢；而與模型組大鼠比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠Caspase-3蛋白表達水平下降，說明海馬組織細胞凋亡趨勢在該組內得到緩解。本次實驗分別在功能水平、細胞水平和分子水平觀察到辛伐他汀可以緩解糖尿病大鼠的認知功能障礙進展。

有研究表明，辛伐他汀可以通過增加Klotho蛋白表達發揮神經保護作用[22-23]。Klotho是一種抗衰老蛋白，具有緩解神經退行性疾病發生發展的作用，而敲除Klotho基因的小鼠在出生8周后就會出現動脈粥樣硬化、骨質疏松、神經元變性等癥狀[3-4,24]。目前有研究認為，Koltho在各類血管因素引發的疾病中發揮重要作用，在腦血管疾病中通過緩解血管鈣化發揮神經保護作用，且其表達水平下降表明神經元受損、神經細胞凋亡等[25]。研究者對已經發生認知功能障礙的老年糖尿病大鼠，長期使用辛伐他汀，測定其腦內海馬區Klotho蛋白表達，觀察辛伐他汀的應用效果，初步觀察其在血管因素引發的認知功能障礙中的作用。在本實驗中，與對照組比較，模型組和糖尿病+辛伐他汀組大鼠，Klotho蛋白表達水平均下降；與模型組比較，糖尿病+辛伐他汀組大鼠的Klotho蛋白表達水平上升，表明大鼠中樞神經系統的損傷使得Klotho蛋白表達水平下降，但持續使用辛伐他汀后糖尿病大鼠的Klotho 蛋白表達水平增加。表明對于已經發生認知功能障礙的糖尿病大鼠，辛伐他汀可能通過影響Klotho蛋白表達，調節血管功能，來緩解認知功能障礙、神經元損傷、細胞凋亡的進一步發生，具有一定程度上的神經保護作用，其機制尚待進一步探討。

辛伐他汀對已經發生認知損傷的糖尿病大鼠的認知功能障礙具有延緩作用，在一定程度上減少細胞凋亡、神經元損傷及認知功能障礙的持續惡化，這種作用可能與 Klotho蛋白有關。