利妥昔單抗治療兒童原發性腎病綜合征機制的研究進展

姚超 段培鋒

濱州醫學院附屬醫院兒童消化與腎病科，濱州 256600

原發性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是兒童常見的腎臟疾病，以大量蛋白尿、低蛋白血癥和/或水腫為臨床特征［1-2］，16歲以下兒童發病率為（1～3）/10萬［3］。其主要病理表現為微小病變型腎病（MCGN）和局灶節段性腎小球硬化（FSGS）。90%的PNS對糖皮質激素敏感，使用潑尼松2 mg/kg治療4周后，尿蛋白即可轉陰，稱為激素敏感型腎病綜合征（SSNS）。10%的PNS對糖皮質激素治療無效，稱為激素抵抗型腎病綜合征（SRNS），同時50%～60%的SSNS表現為激素依賴或頻繁復發，稱為激素依賴型腎病綜合征（SDNS）或頻復發型腎病綜合征（FRNS）。為避免長期使用糖皮質激素引起的骨質疏松、肥胖、垂體抑制等不良反應［4］。RNS患兒常用環磷酰胺、霉酚酸酯、他克莫司/環孢素等免疫抑制劑進行治療。然而即使糖皮質激素聯合免疫抑制劑，仍有20%左右NS表現為復發或者依賴，且長期使用免疫抑制劑具有嚴重的腎臟毒性［4］，因此，迫切需要一種新的更加安全有效的藥物。

利妥昔單抗（rituximab，RTX）是一種針對CD20的單克隆抗體，最早用于治療成人復發的CD20陽性低級別淋巴瘤，近十年來，因其在治療兒童復雜腎病綜合征上的良好效果而備受關注［5］。近年關于其有效性和安全性的研究表明，相較于免疫抑制劑，RTX能顯著降低NS患者的蛋白尿水平，有效延長持續緩解時間，降低復發率［6］，且不良反應相對較輕，亦不具有腎臟毒性［7］，因此，在NS治療領域，RTX是一種極具潛力的新型藥物。但目前對RTX治療PNS的研究多集中在其有效性和安全性上，對其緩解蛋白尿的具體機制研究較少。現對近年來RTX緩解蛋白尿的機制研究進行總結，以期為RTX治療PNS的臨床實踐及研究提供參考。

RTX通過與鞘磷脂磷酸二酯酶類酸3b（SMPDL-3b）結合阻止足細胞損傷

研究表明足細胞的損傷是導致蛋白尿的重要原因，而足細胞結構和功能的完整性對維持腎小球濾過屏障有著重要的作用［8］。足細胞復雜的三維形態依靠肌動蛋白相關的細胞骨架維持，細胞骨架的崩解是造成足細胞損傷的重要原因［9］。Palladin是一種與肌動蛋白有關的蛋白，在維持細胞骨架穩定性上起著重要作用［10］。Artelt等［10］研究發現，與對照組相比，特異性敲除足細胞palladin的小鼠出現了腎小球形態紊亂，足細胞間隙增大，輕度凋亡。有學者發現，糖尿病腎病和FSGS患者的腎活檢標本也顯示足細胞中Palladin的下調。這些研究表明，正常的細胞骨架結構對維持足細胞的功能有著重要作用。

SMPDL-3b是一種將鞘磷脂轉化為神經酰胺的脂質修飾酶，在巨噬細胞、樹突狀細胞和足細胞上顯著表達［11］。SMPDL-3b通過負性調節toll樣受體參與細胞信號轉導、足細胞骨架調節及固有免疫的負性調節［12］。SMPDL-3b已被報道參與足細胞細胞骨架的調節。Ahmad等［13］發現輻射能誘導足細胞骨架重塑，但高表達SMPDL-3b的足細胞能在輻射下保持細胞骨架的穩定，同時SMPDL-3b的下調使足細胞更容易發生肌動蛋白的重塑。

Fornoni等［14］對12例未復發的FSGS患者和8例復發的FSGS患者進行腎臟活檢分析，發現復發型FSGS患者SMPDL-3b+足細胞的數量低于非復發型FSGS。同時用正常人的血清和反復復發的FSGS患者血清分別體外培養足細胞，發現與正常人血清培養的足細胞相比，反復復發的FSGS患者血清培養的足細胞其SMPDL-3b mRNA明顯下調。這表明SMPDL-3b在反復復發的FSGS患者中表達下降。但RTX可以阻止足細胞中SMPDL-3b的下調。Takahashi等［15］分別用RTX（10 mg/kg）和提純的人免疫球蛋白（Ig）G治療阿奇霉素誘導的腎病大鼠，每周1次，分別于第1、5、7、14、28天采集尿液標本，用免疫熒光染色和聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測蛋白尿、SMPDL-3b和足細胞相關蛋白的表達。免疫熒光顯示，在第28天時，用RTX治療的大鼠其SMPDL-3b及SMPDL-3 bmRNA的表達明顯高于人IgG處理組（P＜0.001），高于正常組（P＜0.01）。此外，用RTX處理正常大鼠，注射RTX 24 h后，SMPDL-3b mRNA的表達明顯增高（P＜0.01）。這些結果表明，RTX能通過與SMPDL-3b的結合，阻止SMPDL-3b在足細胞內的下調，從而穩定足細胞肌動蛋白細胞骨架，避免足細胞損傷，緩解蛋白尿。

但部分學者對于RTX是否與SMPDL-3b特異性結合仍有質疑。Kim等［16］用RTX和抗透明質酸（HA）標記抗體孵育非固定細胞，在表達HA-SMPDL-3b的293T細胞中，可用HA抗體進行染色，但不能用RTX進行染色。并且當細胞在抗體染色前用多聚甲醛固定時，Kim等［16］觀察到RTX與細胞的結合與SMPDL-3b的表達無關。在過表達HA-SMPDL-3b的HeLa細胞中也得到了類似的結果。這些結果表明，RTX在體內可能不與SMPDL-3b結合，RTX對腎病的療效可能并不是通過與SMPDL-3b結合直接調節足細胞來實現的。

RTX通過耗竭B細胞參與蛋白尿的緩解

B細胞作為一種免疫細胞參與NS的發病。Dossier等［17］發現特發性腎病綜合征（INS）患者外周血總B細胞計數在緩解期明顯減少。Colucci等［18］對INS患兒在使用糖皮質激素治療前進行采血，發現較對照組而言，INS患兒的B細胞明顯增多。Kidoguchi等［19］也曾報道過1例由彌漫性大B細胞瘤繼發膜性腎病的病例。這些證據表明，B細胞可能在NS的發展中起著重要作用。

CD20抗原是一種高表達于前期至晚期B淋巴細胞上的磷酸化蛋白，在B細胞分化為漿細胞后消失。CD20通過調節跨膜鈣離子流，對B細胞的增殖和分化起著重要的調節作用［20］。RTX作為一種人鼠嵌合單克隆抗體，其鼠源區Fab段能特異性和CD20結合，通過抗體依賴細胞介導的細胞毒作用、補體依賴的細胞毒作用以及啟動Caspase-3介導的信號轉導通路誘導細胞凋亡等機制清除B細胞［21］。

1、RTX減少炎癥因子的分泌

B細胞源性細胞因子是NS發病的重要原因。B細胞激活后會分泌各種細胞因子，包括干擾素-γ、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13等［22］，這些細胞因子介導足細胞的免疫損傷。Kim等［16］在小鼠實驗中證實IL-4、IL-13通過激活酪氨酸激酶JAK1和JAK3，啟動轉錄因子STAT6，促進肌動蛋白骨架的形成，誘導足細胞褶皺、足突消失。McDonald等［23］研究發現RTX可以降低特異性濕疹患者血清中IL-13的水平。Ma等［24］將野生型雄性C57BL/6J小鼠采用腹橫主動脈縮窄法進行壓力負載，然后靜脈注射RTX 4周，用實時熒光定量PCR分析心臟組織中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA水平（6例）。免疫印跡顯示，與對照組相比，RTX顯著降低促炎細胞因子mRNA和蛋白質的表達，同時細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）、STAT3、轉 化 生 長 因 子β（TGFβ）/Smad2/3和IKKα/β/核 轉 錄 因子-κB（NF-κb）等多種信號通路顯著減少。這表明RTX阻斷了CD20介導的B細胞激活，從而抑制IKK/NF-κb信號通路介導的促炎因子的釋放，阻止炎癥因子對足細胞的損傷。

2、RTX抑制抗體的分泌

B細胞分化為漿細胞后分泌的抗體也參與NS的發病，RTX能間接抑制抗體的分泌。在部分腎病患兒體內觀察到Ig水平出現明顯改變，表現為急性期IgG明顯降低及IgE明顯升高。Jamin等［25］亦觀察到部分INS患者外周血抗泛素羧基末端水解酶-1（UCHL-1）抗體明顯升高，而健康對照組則未曾檢測到此抗體。正常小鼠注入UCHL-1抗體可以誘導足突廣泛融合并產生大量蛋白尿，提示該抗體可能參與了部分INS患者的發病。Ma等［24］用酶聯免疫吸附試驗法分析腹橫主動脈縮窄誘發心肌重構患者體內的Ig水平，發現RTX處理組的IgG水平較對照組明顯下降，提示RTX可能降低B細胞分泌抗體的水平。分泌抗體的漿細胞表面并不表達CD20，故RTX并不直接抑制漿細胞抗體分泌。目前多數學者認為Th2型細胞因子如IL-4、IL-5和IL-10等能刺激B細胞產生抗體，而RTX能阻斷CD20介導的B細胞活化，從而減少Th2型細胞因子的產生，間接導致抗體水平的降低［24］。

RTX通過調節T細胞亞群緩解蛋白尿

一直以來，T細胞就被認為是造成足細胞損傷的主要免疫細胞。早在40多年前，Shalhoub［26］認為MCGN是由功能失調T細胞產生的循環因子誘導的。近年來研究表明，T細胞是足突消失和誘發蛋白尿的主要效應細胞。T細胞亞群失衡及調節性T細胞（Treg）數量和功能的下降在蛋白尿的發生發展過程中起著重要作用［27］。

Th1/Th2的平衡對維持機體正常的免疫功能至關重要，Th1/Th2失衡與自身免疫性疾病、過敏性疾病、腫瘤和移植排斥反應等的發生和發展有著密切關系［28］。Kanai等［29］用配對樣本來測量SSNS患者中Th1/Th2比率和Th1和Th2分泌的細胞因子水平，發現在SSNS活動期Th1細胞明顯降低，Th2細胞及其產生的細胞因子IL-5明顯升高，Th1/Th2比值下降，而在緩解期，Th1和Th2的水平趨于正常。這提示INS的發病與Th1/Th2比例失衡造成的T細胞免疫功能紊亂存在著密切關系。近些年有研究表明RTX可以重塑Th1和Th2的亞群比例。Bhatia等［28］進行一項前瞻性研究，他們采集了18例SDNS患者在RTX治療前、1個月、1年后及首次復發時的血液和尿液樣本，并用流式細胞術檢測樣本中T淋巴細胞及其亞群的數量和比例，發現在RTX治療后Th2細胞計數下降（P=0.004 1），而Th1計數無顯著差異；在復發患者中，Th2細胞計數增加（P=0.007 8）。與對照組相比，患者的Th1/Th2比值更低［患者基線：7.7（3.2～13.2）比對照組15.9（10.5～20.4）；P=0.001 8］，RTX治療1個月后，這一比例增至14.0（6.6～24.5）（P=0.010 2），但在復發期，Th1/Th2比值又明顯下降。這些結果表明RTX可以降低Th2細胞的絕對數量，從而上調Th1/Th2的細胞亞群比例，改善T細胞亞群失衡引起的免疫紊亂狀態。

Treg功能紊亂及輔助性T細胞17（Th17）/Treg比例失衡是INS發生發展的另一個重要原因。Chan等［30］發現INS患兒Treg增多時，蛋白尿明顯減少。Li等［31］發現INS兒童外周血單核細胞中Th17細胞增多，Treg數目減少。Th17能促進足細胞發生凋亡［32］，但其導致蛋白尿的機制尚不十分清楚，Wang等［32］認為可能和Th17誘導足細胞骨架蛋白穩定性下降有關，而Treg可以阻止這一過程。最近的研究表明，RTX可以增加Treg數量并恢復其調節功能。Garin等［33］曾用流式細胞術檢測接受RTX治療的慢性特發性血小板減少性紫癜（ITP）患者的Treg，發現與對照組相比，ITP患者的Treg數量減少，抑制能力缺陷，但在使用RTX治療后，Treg的數量及調節功能均明顯恢復。也有報道指出，活動性膜性腎病患者在使用RTX獲得臨床緩解后，Treg比基線增加了10倍［34］。Bhatia等［28］的前瞻性試驗顯示，與對照組相比，SDNS患者在RTX治療1月后，Th17細胞的中位數比例由1.3降至0.7（P=0.025），Th17的絕對值計數也隨之下降，患者的Treg比值隨之上升（P=0.000 2）。這些研究結果表明RTX可以影響T細胞的分化，下調Th17的表達，上調Treg的數量及活性，通過重置Th17/Treg比例改善紊亂的T細胞免疫，從而達到蛋白尿的緩解。

目前關于RTX如何影響Treg和Th17的具體機制尚不十分清楚，可能和其B細胞耗竭有關。Chan［30］推測RTX可能是通過耗竭B細胞及其細胞因子IL-6和TGFβ來調節Th17的分化。有研究表明RTX可以降低類風濕關節炎患者的局部Th17反應，但在B細胞缺失的情況下，RTX對Th17的抑制效應消失，提示B細胞在Th17反應的發展中起到了重要作用，為RTX通過耗竭B細胞來抑制Th17反應提供了證據［35］。Ciccia等［36］則認為RTX通過誘導肥大細胞的凋亡來抑制Th17的分化和IL-17的釋放。Eggleton和Bremer［37］則在類風濕關節炎患者中發現部分產生IL-17的CD3+CD4-CD8-T細胞（“雙陰性”T細胞）和CD4+Th17在細胞表面共表達CD20。Holley等［38］亦在多發性硬化患者的血液和大腦中發現CD20+Th17細胞。這表明，部分T細胞可以直接表達CD20，而RTX可以通過和T細胞表面的CD20分子特異性結合，誘導Th17細胞的直接耗竭。但具體相關機制仍有待進一步研究。

結語與展望

INS是兒童常見的腎臟疾病，RTX治療INS，尤其是難治性腎病綜合征的有效性和安全性越來越受到肯定。RTX一方面通過非免疫調節作用，穩定足細胞的細胞骨架，避免足細胞的崩解，另一方面通過調控免疫細胞數量及亞群，重塑失衡的免疫功能，避免足細胞的免疫損傷。但有些具體機制仍有待進一步的探索和研究。