某制藥車間無菌工藝模擬試驗研究

楊惠毛，田治文，范利華

（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 紹興 312500）

目前，市場上非終端滅菌產(chǎn)品越來越多，各國對無菌工藝驗證的要求也越來越高。2016年至2018年，山東省共完成無菌制劑《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范》（GMP）認證94家/次，其中非最終滅菌產(chǎn)品企業(yè)54家/次，占57.45%[1］。即使所有與產(chǎn)品無菌性有關的設備部件、容器及原料都經(jīng)過有效的滅菌處理，仍有可能因各種原因導致產(chǎn)品被污染，產(chǎn)品無菌性得不到保證。故無菌生產(chǎn)工藝的無菌性評估驗證必須從整體考慮，其中培養(yǎng)基模擬灌裝試驗是有效的方法。2010年修訂版GMP無菌藥品第四十七條要求：“無菌生產(chǎn)工藝的驗證應當包括培養(yǎng)基模擬灌裝試驗。”[2］《藥品GMP指南（無菌藥品）》要求，“為確保無菌產(chǎn)品的無菌性，滅菌和無菌灌封工藝須經(jīng)過充分驗證”“應采用培養(yǎng)基代替藥品進行灌裝對無菌工藝進行驗證”[3］。基于各項法規(guī)和車間實際情況，為確認一個新的設施、生產(chǎn)線或工藝的凍干粉針車間，會進行至少3次連續(xù)成功的無菌工藝模擬（APS），并每6個月進行1次持續(xù)工藝評估[3］，每次至少1批，作為對無菌操作人員衛(wèi)生水平及無菌操作水平的檢定。故本研究中從培養(yǎng)基選擇、影響因素考察、試驗過程及試驗結果等方面對培養(yǎng)基模擬灌裝試驗展開研究。現(xiàn)報道如下。

1 驗證前準備

1.1 相關設備及其工藝均應事先通過確認或驗證[4］

潔凈生產(chǎn)區(qū)環(huán)境須通過靜態(tài)驗證，空氣的懸浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均應符合相應規(guī)定；所用物料（西林瓶、膠塞、鋁蓋）通過相關滅菌驗證；主要生產(chǎn)設備（灌裝壓塞機、無菌隔離器等），以及與生產(chǎn)相關的其他輔助工藝（濕熱滅菌、干熱滅菌等）均通過確認或驗證；操作人員的操作行為需經(jīng)嚴格培訓，并通過考核。

1.2 培養(yǎng)基選擇與微生物生長性能

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）液體培養(yǎng)基均適用于培養(yǎng)基模擬灌裝試驗[4］，故初步選定3%TSB液體培養(yǎng)基作為模擬灌裝用培養(yǎng)基。為使其能充分適用于本生產(chǎn)車間，參考文獻[5］制訂《潔凈區(qū)厭氧菌測試方案》，以檢測車間生產(chǎn)環(huán)境中的微生物。依據(jù)潔凈區(qū)環(huán)境監(jiān)測規(guī)程，由專業(yè)人員對潔凈區(qū)的沉降菌、浮游菌和表面微生物進行取樣和監(jiān)測。微生物按基因測序方法鑒定，細菌按16S rDNA方法鑒定，真菌按rDNA-ITS擴增法鑒定，結果所有采集到的微生物均可在TSB液體培養(yǎng)基中生長良好，故確定本次APS試驗的培養(yǎng)基為TSB液體培養(yǎng)基。其中，腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、土壤羅斯氏菌、沃氏葡萄球菌、科氏葡萄球菌均為需氧菌或兼性厭氧菌，耐冷假單胞菌為需氧菌。

2 APS試驗設計與結果

2.1 最差條件選擇

《無菌工藝模擬試驗指南》中規(guī)定：“最差條件并不是指人為創(chuàng)造的超出允許范圍的生產(chǎn)狀況和環(huán)境。為了確認無菌工藝風險控制的有效性，應通過風險評估并結合無菌生產(chǎn)工藝、設備裝備水平、人員數(shù)量和干預等因素來設計模擬試驗最差條件。”[6］美國注射劑協(xié)會（PDA）發(fā)布的Process Simulation for Aseptically Filled Products規(guī)定：“應對預期的干預進行評估，以確定微生物風險的數(shù)量和對產(chǎn)品或工藝的影響。由于干預的復雜性和執(zhí)行頻率，對產(chǎn)品及工藝會產(chǎn)生較高的風險，APS試驗中的干預應高于正常頻率。”故進行APS試驗最差參數(shù)選擇和干預操作選擇，并進行最差條件挑戰(zhàn)。詳見表1和表2。

表1 無菌工藝模擬試驗最差參數(shù)選擇Tab.1 Selection of the worst parameters of the APS test

表2 無菌工藝模擬試驗干預操作選擇[7］Tab.2 Selection of the intervention operations of the APS test[7］

2.2 APS試驗

APS試驗操作流程見圖1。具體操作如下。

圖1 無菌工藝模擬試驗操作流程Fig.1 Operation flow of the APS test

無菌培養(yǎng)基配制：配制3%TSB液體培養(yǎng)基，按30 g TSB凍干粉配制成1 000 g TSB液體培養(yǎng)基比例配制。按比例取一定量的注射用水置配制罐中，并冷卻至30～35℃。按比例稱取TSB凍干粉，溶于配制罐中，攪拌溶解，pH控制為7.3±0.2，經(jīng)0.45μm和0.20μm濾芯過濾后進入無菌儲罐。最差條件的存放時限后經(jīng)終端0.20μm除菌濾芯過濾至高位罐，進行無菌灌裝加塞操作。

無菌培養(yǎng)基灌裝：培養(yǎng)基灌裝過程按產(chǎn)品生產(chǎn)工藝操作要求進行模擬，按表1模擬最差的灌裝條件和表2模擬固有干預操作和糾正性干預操作，并確保所有模擬干預操作在培養(yǎng)基藥液灌裝時進行。基于風險評估設計，將所有灌裝半壓塞好的培養(yǎng)基藥液運送至凍干箱，并平均分布于凍干箱上、中、下板層上[6］。整個灌裝過程中的剔廢品應全部編號并拍照。由質量管理人員對無菌隔離器中的整個灌裝過程進行全程觀察，并詳細記錄灌裝過程中灌裝崗位人員非計劃性操作情況。且對整個模擬灌裝過程進行全程攝像，便于后續(xù)分析和解決問題。

凍干壓塞：樣品全部進入凍干箱后，關好凍干機小門，對凍干箱抽真空至0.05 MPa[8］，存放于凍干機內模擬凍干時間，關閉蘑菇閥和抽真空系統(tǒng)，用經(jīng)除菌過濾的壓縮空氣破空后再次抽真空至0.05 MPa，關閉抽真空系統(tǒng)，壓塞后破空。

軋蓋：對從凍干箱出來的培養(yǎng)基灌裝產(chǎn)品進行軋蓋。軋蓋前剔廢的未加塞西林瓶及完整性有缺陷的西林瓶（如西林瓶破裂、漏液）均不送最終培養(yǎng)，但必須每瓶編號并拍照，根據(jù)剔廢原因標記。

培養(yǎng)與檢查：充分搖晃待培養(yǎng)品（確保接觸西林瓶內表面）后，倒立放置，于20～25℃培養(yǎng)室內至少培養(yǎng)7d；觀察后，正放置于30～35℃的培養(yǎng)室內至少培養(yǎng)7 d[9］。檢查須由具有資質的人員執(zhí)行，如中途檢查在培養(yǎng)室外進行，應對檢查時間進行補償，保證培養(yǎng)的總時間。在檢查和轉運過程中，若出現(xiàn)意外碎瓶，應拍照并記錄[10］。培養(yǎng)基模擬灌裝試驗的目標遵循EU GMPAnnex 1：Manufacture of Sterile Products DRAFT 20200220提出的“目標應為無微生物生長。任何被污染的單元應致使工藝模擬失敗”。

培養(yǎng)基培養(yǎng)后促生長試驗：對培養(yǎng)至少14 d結束后的樣品取樣并進行促生長試驗，采用2020年版《中國藥典（三部）》要求的5種標準菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌）進行促生長測試。此外，采用環(huán)境分離菌進行促生長測試，環(huán)境分離菌篩選原則有，選取日常環(huán)境監(jiān)測中典型的微生物及出現(xiàn)頻率較高的微生物；盡可能從關鍵區(qū)域回收的微生物中選用，如灌裝間等；特定環(huán)境菌從近期收集到的微生物中選取，盡量在近6個月內，最長不超過12個月。依據(jù)《美國藥典43版》1113、2020年版《中國藥典（四部）》9204微生物鑒定指導意見和《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，本車間每6個月對回收的微生物樣本進行鑒定。結果見表3。

表3 潔凈區(qū)微生物鑒定結果Tab.3 Results of microbial identification in the clean area

環(huán)境監(jiān)測與模擬灌裝后清洗：對整個模擬灌裝過程進行環(huán)境監(jiān)測，確保潔凈區(qū)的環(huán)境在動態(tài)中符合GMP要求。模擬灌裝結束后，按車間相關清潔規(guī)程對設備進行清潔，分別用淋洗法和擦拭法對設備淋洗水和設備表面進行取樣，進行殘留、微生物限度、細菌內毒素檢測[11］，以確定不會對下次生產(chǎn)產(chǎn)生影響。

2.3 APS試驗結果

本次APS試驗中，灌裝完成的產(chǎn)品均無微生物生長；且對培養(yǎng)14 d后的樣品進行微生物促生長試驗，科氏葡萄球菌、藤黃微球菌、堅強芽孢桿菌、膠紅酵母菌、奧斯陸莫拉氏菌和耐鹽枝孢菌6種環(huán)境分離菌均生長良好。表明本次APS試驗成功，該批操作人員按此生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品無菌性可靠。

3 討論

該凍干車間基于2010年版GMP無菌藥品附錄、PDA發(fā)布的Process Simulation for Aseptically Filled Products等法規(guī)和指導性技術報告，對整個生產(chǎn)工藝、設備、人員、物料、環(huán)境等多個系統(tǒng)，以及無菌過程中產(chǎn)品可能易于被微生物污染的潛在薄弱環(huán)節(jié)進行APS試驗，結果所有灌裝完成的產(chǎn)品都達到了零污染的目標，符合高標準無菌保證。可見，該凍干車間在工程設計、生產(chǎn)控制、活動干預、質量體系、人員培訓、書面規(guī)程、環(huán)境控制、環(huán)境監(jiān)測等方面均嚴格遵守了無菌技術，可保障無菌制劑產(chǎn)品生產(chǎn)過程的無菌性，確保無菌制劑的安全性。本研究結果對實際生產(chǎn)具有指導意義，是日常生產(chǎn)操作的依據(jù)，有助于實現(xiàn)與國際醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的接軌。