喉痛靈制劑中重金屬及有害元素與禁用農藥殘留量測定*

張 美，董文靜，王 榮，張 瑤，楊建興，李 智，吳少濤，馬桂娟，田 雨，王 慶△

（1.寧夏回族自治區藥品檢驗研究院，寧夏 銀川 750000；2.寧夏回族自治區食品檢測研究院，寧夏 銀川 750000；3.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004）

喉痛靈制劑處方由水牛角濃縮粉、野菊花、荊芥穗、板藍根或南板藍根4味藥材組方，具有清熱解毒、消炎、利咽喉功效，用于治療咽喉炎、急性化膿性扁桃體炎、感冒發熱、上呼吸道炎、疔瘡等[1］。重金屬及有害元素與農藥殘留是影響中藥安全性的主要外源性污染物。重金屬及有害元素會引起不同程度的中毒，農藥蓄積會引起心腦血管疾病、肝病等[2］。農藥的慢性危害雖不能直接危及人的生命，但可降低人體免疫力，影響人體健康。本研究中參考重金屬及有害元素[2-11］和農藥殘留[2，11-13］的測定方法，采用電感耦合等離子體-質譜（ICP-MS）法測定喉痛靈制劑中鉛、鎘、砷、銅、鈣元素，采用原子熒光法測定汞元素（Hg），采用氣相色譜串聯質譜（GCMS/MS）法和超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法篩查喉痛靈制劑中的33種禁用農藥，為該制劑的安全用藥和質量控制提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7700e型電感耦合等離子體質譜儀，Agilent1290型液相色譜儀-Agilent6460型三重四極桿質譜儀，均購自美國Agilent公司；AFS-9750型原子熒光光度計（北京海光儀器有限公司）；Mettler Toledo XS-205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為萬分之一）；Milli-Q A10 System型超純水儀（美國Millipore公司）；MARS-6型微波消解儀（美國CEM公司）；BHW-09C型趕酸儀（美國Perkin Elmer公司）；TQ8040型氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（日本島津公司）；BUCHI Rotavapor R-300型旋轉蒸發儀（瑞士步琦公司）；SIGMA 3K15型離心機（德國Sigma公司）；Organomation MULTIVAP型氮吹儀（美國Organomation公司）；Vortex-genie 2型漩渦混合器（美國SI公司）。

1.2 試藥

硝酸（優級純，美國Sigma-Alorich公司）；過氧化氫（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；鉛標準溶液（批號為GBW＜E＞080129-14062，質量濃度為100μg/mL），鎘標準溶液（批號為GBW＜E＞080119-15061，質量濃度為100μg/mL），砷標準溶液（批號為GBW＜E＞080117-15022，質量濃度為100μg/mL），汞標準溶液（批號為GBW＜E＞080124-14124，質量濃度為100μg/mL），銅標準溶液（批號為GBW＜E＞080122-18121，質量濃度為1 000μg/mL），鈣標準溶液（批號為GBW＜E＞080118，質量濃度為1 000μg/mL），均購自中國計量科學研究院；水為超純水。CDAA-M-490360-JA-1 mL 33種農藥混標（GC-MS/MS組，100 mg/L于乙腈，1 mL），CDAA-M-490361-JA-1 mL 30種農藥混標（LC-MS/MS組，100 mg/L于乙腈，1 mL），CDAA-S-412134-JD-1 mL三苯基磷酸酯（內標，1 000 mg/L于乙腈，1 mL），均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。喉痛靈片、喉痛靈顆粒產品信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 重金屬及有害元素測定

2.1.1 試驗條件

ICP-MS工作參數由儀器自動調諧設定，以靈敏度、背景、穩定性等各項指標對儀器參數進行優化，確定了工作參數。ICP-MS工作參數：射頻功率為1 550 W；ICP RF功率為1 550 W；載氣流速為1.0 L/min；輔助氣流速為1.0 L/min。ICP-MS調諧參數：鋰（Li）為（7±0.1）amu，Max Intensity≥3 000；釔（Y）為（89±0.1）amu，Max Intensity≥1 000；鉈（Ti）為（205±0.1）amu，Max Intensity≥6 000。

原子熒光分光光度計工作參數：總燈電流為25 mA；負高壓為280 V；載氣流速為400 mL/min；屏蔽氣為1 000 mL/min；原子化氣高度為10 mm。

2.1.2 溶液制備

標準溶液：精密量取鉛、砷、鎘、銅、汞、鈣單元素標準溶液各適量，用10%硝酸溶液稀釋成質量濃度鉛、砷、鎘分別為1，5，10，30，50μg/mL的系列標準溶液，銅為10，50，100，300，500μg/mL的系列標準溶液，鈣為0.4，2，4，12，20μg/mL的系列標準溶液，汞為0.4，0.8，1.2，1.6，2.0μg/L的系列標準溶液。

供試品溶液：取樣品0.5 g，精密稱定，置50 mL干凈的消解罐中，加入硝酸5 mL、過氧化氫1 mL，室溫預消解30 min，置微波消解儀內按程序消解。消解完畢，使消解罐自然冷卻至室溫，緩慢擰松消解罐蓋，將消解罐置趕酸儀插孔中，加熱至70℃趕酸30 min，將消解液轉移至50 mL容量瓶中，用水清洗消解罐及其蓋子5次，將清洗液合并于容量瓶中，用水定容，搖勻，即得。

2.1.3方法學考察

線性關系考察：分別精密量取2.1.2項下系列單一標準溶液適量，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（X）為橫坐標、信號強度或峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

表2 6種重金屬及有害元素線性關系考察結果（n=5）Tab.2 Results of the linear relation tests of six heavy metals and harmful elements（n=5）

重復性試驗：取樣品（編號16）0.5 g，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄信號強度，并計算汞、鉛、鎘、砷、銅、鈣含量。結果的RSD分別為3.52%，3.04%，2.80%，2.72%，2.11%，2.13%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（編號16）0.5 g，精密稱定，共6份，加入同一質量濃度的混合標準溶液，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄信號強度，并計算回收率。結果汞、鉛、鎘、砷、銅、鈣的平均回收率分別為86.82%，90.61%，92.64%，95.48%，101.19%，93.67%，RSD分 別 為3.83%，3.22%，3.23%，3.01%，2.51%，2.70%（n=6）。

2.1.4 含量測定

取樣品0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄信號強度，并計算含量。結果見表3至表4。

表3 14批喉痛靈片樣品中6種重金屬及有害元素含量測定結果（μg/片）Tab.3 Results of the content determination of six heavy metals and harmful elements in the 14 batches of Houtongling Tablets samples（μg/tablet）

表4 21批喉痛靈顆粒樣品中6種重金屬及有害元素含量測定結果（μg/g）Tab.4 Results of the content determination of six heavy metals and harmful elements in the 21 batches of Houtongling Granules samples（μg/g）

2.2 禁用農藥殘留測定

2.2.1 試驗條件

GC-MS/MS色譜條件：色譜柱為DB-17（50%苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進樣口溫度為250℃，不分流進樣；載氣為高純氦氣（He）；進樣口為恒壓模式，柱前壓為146 kPa，流速為1.5 mL/min；進樣量為1μL；采用程序升溫，初始溫度為60℃、保持1 min，以30℃/min的速率升至120℃，以10℃/min的速率升至160℃，以2℃/min的速率升至230℃，以15℃/min的速率升至300℃后，保持6 min。質譜條件：以三重四極桿串聯質譜儀檢測，離子源為電子轟擊（EI）源，離子源溫度為250℃；碰撞氣為氬氣；質譜傳輸接口溫度為250℃；質譜監測模式為多反應監測（MRM）。33種農藥中33個農藥組分的離子及電壓監測結果見表5。

表5 GC-MS部分33個農藥組分離子及電壓監測結果Tab.5 Results of the ion and voltage monitoring of 33 pesticide components by the GC-MS

LC-MS/MS色譜條件：色譜柱為Zorbax SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40℃；流動相A為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨），流動相B為0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L甲酸銨-乙腈）-乙腈（5∶95，V/V），梯度洗脫（程序見表6）。質譜條件：以三重四極桿串聯質譜儀檢測，離子源為電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式，監測模式為MRM。33種農藥中30個組分的離子及電壓監測見表7。

表6 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.6 Program of gradient elution of mobile phase（%）

表7 LC-MS部分30個農藥組分離子及電壓監測結果Tab.7 Results of the ion and voltage monitoring of 30 pesticide components by the LC-MS

2.2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取33種農藥混標（GC-MS/MS組）100 mg/L和30種農藥混標（LC-MS/MS組）的混合對照品，用乙腈稀釋至10μg/mL，即得。

供試品溶液：1）直接提取法。取供試品粉末（過3號篩）5 g，精密稱定，加氯化鈉1 g，立即搖勻，再加入乙腈50 mL，勻漿處理（轉速12 000 r/min）2 min，離心（轉速為4 000 r/min），取上清液，沉淀，再加乙腈50 mL，勻漿處理1 min，離心，取上清液，合并2次提取的上清液，減壓濃縮至約3～5 mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0 mL，搖勻，即得。2）快速樣品處理（QuEChERS）法。取供試品粉末（過3號篩）3 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（轉速為500次/分）5 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉混合粉末（4∶1，m/m）7.5 g，立即搖勻，再置振蕩器上劇烈振蕩（轉速為500次/分）3 min，于冰浴中冷卻10 min，離心（4 000 r/min）5 min，取上清液9 mL，置預先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（轉速為500次/分）5 min使凈化完全，離心（轉速為4 000 r/min）5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約0.4 mL，加乙腈稀釋至1.0 mL，渦旋混勻，濾過，取續濾液，即得。

空白基質溶液：取空白樣品，分別按不同供試品溶液的制備方法制備空白基質溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察與檢測限確定：分別精密量取2.2.2項下對照品溶液，用已制備的空白基質溶液稀釋至質量濃度分別為2，5，10，25，50，100，200 ng/mL的標準工作液，以質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。逐級稀釋以線性關系考察最低點質量濃度為2 ng/mL的對照品溶液，以各物質定量離子對色譜信號3倍信噪比（S/N）確定各物質方法的檢測限。結果見表8和表9。

加樣回收試驗：取空白基質樣品適量，分別按照2.2.2項下2種供試品處理方法處理空白基質，各6份，分別加入同一質量濃度（50 ng/mL）的單一對照品溶液，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表8和表9。

表8 GC-MS部分33個農藥組分回歸方程、檢測限與回收率Tab.8 Regression equations，limits of detection and recovery rates of 33 pesticide components by the GC-MS

表9 LC-MS部分30個農藥組分回歸方程、檢測限與回收率Tab.9 Regression equations，limits of detection and recovery rates of 30 pesticide components by the LC-MS

精密度及穩定性試驗：取加樣回收試驗中的任意一份樣品，重復進樣測定6次，計算精密度，結果的RSD均小于6.50%（n=6）；同時，分別于第2，3，4，5，6，7天進樣測定，計算精密度，并考察樣品的穩定性，結果的RSD均小于7.04%（n=6）。表明儀器的精密度和樣品的穩定性均良好。

2.2.3 禁用農藥殘留量測定

取35批樣品各適量，分別按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下試驗條件分別進樣測定，平行3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果35批樣品均未檢出農藥殘留，可初步確定喉痛靈制劑農藥殘留安全風險較低。

3 討論

3.1 重金屬及有害元素測定

鉛、鎘、砷、汞、銅是環境中主要的無機污染元素，當這些重金屬元素在體內蓄積到一定濃度時，可危害中樞神經、血液及各個器官，導致類阿茲海默癥、帕金森病，甚至有致癌風險[2-11］。依據2020年版《中國藥典（四部）》對重金屬限量的要求，結合國家藥典委員會中藥風險評估專業委員會建議，提出植物類中藥材中鉛、鎘、砷、汞、銅一致性限量值分別為5，1，2，0.2，20 mg/kg。參考喉痛靈片國家藥品標準[1］和喉痛靈顆粒國家藥品標準[14］，以及文獻[15-18］水煎煮條件下鉛、鎘、砷、汞、銅的轉移率分別為14%，14%，35%，24%，15%，以各重金屬元素的限量乘以處方量再乘以轉化率，最終得到喉痛靈片鉛、鎘、砷、汞、銅元素的限量分別為每片2.17，0.434，2.17，0.15，9.15μg；喉痛靈顆粒鉛、鎘、砷、汞、銅元素的限量分別為2.17，0.434，2.17，0.15，9.15μg/g。

喉痛靈片中各重金屬及有害元素均在所制定的安全限度范圍內，喉痛靈顆粒有1批樣品中汞元素平行樣品所測含量為0.97μg/g（設定限量為0.15μg/g）。通過復測，結果一致。同時，將該企業生產的喉痛靈顆粒共3批均進行了測定。結果另外2批測定結果分別為0.73μg/g和0.75μg/g，3批均超過擬定限量。此外，經過廠家與批次間的比對分析，發現廠家與廠家間，同一廠家不同批次間的重金屬元素測定結果差異較大，其中江蘇某藥業有限公司15批樣品砷含量平均為0.21μg/g，銅含量平均為0.72μg/g，汞含量普遍高于其他企業。處方中投入了水牛角濃縮粉，除鉛、鎘、砷、汞、銅元素外，增加了鈣元素的測定，各廠家最高與最低之間的含量相差50多倍，可能存在投料問題，需進一步考察研究。本試驗中重金屬元素測定結果可為企業考察原料藥材質量、優化生產條件、控制外源污染，進一步提高產品質量提供參考。

3.2 禁用農藥殘留測定

參考2020年版《中國藥典（四部）》33種禁用農藥的測定方法及文獻[12-13］，優化了儀器測定參數，并比較了2種供試品的前處理方法，以儀器相應較好且受基質影響小的測定數據作為最終測定結果。經文獻調研發現，喉痛靈制劑處方中野菊花、板藍根或南板藍根中會有33種禁用農藥中的部分農藥，故對成方制劑的農藥殘留進行測定，以綜合考察處方原藥材中的農藥殘留，為中成藥安全用藥及中藥材質量控制提供參考。