水分活度對黑根霉生長的影響

王杠杠，王似錦，馬仕洪

（中國食品藥品檢定研究院·化學藥品質量研究與評價重點實驗室，北京 100050）

水分活度（Aw）對于評價藥品中微生物污染和增殖的風險具有重要意義[1-4］。Aw是指在相同溫度下，產品的蒸氣壓與純水的蒸氣壓的比值乘以100，即為等效相對濕度[5］。1957年，澳大利亞科學家SCOTT提出影響微生物生長的是Aw而非水分含量，每種微生物都存在最低生長Aw，低于該限值微生物將不能生長[6］。20世紀80年代，美國食品藥物管理局（FDA）在食品生產中采用Aw檢測對微生物進行控制，《美國藥典》（USP）第29版也于2006年8月正式頒布＜1112＞Aw測定在非無菌藥品上的應用，指出測量非無菌藥品的Aw有助于優化處方，提高防腐體系的抑菌效果，降低處方（尤其是液體、膏、乳液和霜）受微生物污染的風險，并收錄了代表微生物的最低生長Aw[7］。近年來，國內報道了部分制藥行業代表性微生物生長所需的最低Aw[8-12］。黑根霉（Rhizopus stolonifer，曾用名Rhyzopus nigricans）又名匍枝根霉，是導致物質腐爛變質的常見污染菌。20世紀40年代，有學者研究了環境濕度對黑根霉孢子萌發的影響[13］。USP＜1112＞中收錄的黑根霉最低生長Aw為0.93，但黑根霉在低于該Aw的條件下仍可生長[14-15］。為驗證USP＜1112＞中收錄的黑根霉最低Aw的準確性，本研究中選取1株黑根霉標準菌株作為研究對象，分別于氯化鈉、甘油、蔗糖調節的不同Aw條件下培養，并觀察菌落變化，分析不同調節劑作用下Aw對黑根霉生長的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：黑根霉（Rhizopus stolonifer）CGMCC 3.10。

試劑與培養基：氯化鈉（美國Sigma公司，批號為SZBE0490V）；甘油（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20180401）；蔗糖（北京糖業煙酒集團有限公司，批號為20181011）；沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養基（美國BD公司，批號為7135844）；S-Pak濾膜（美國Millipore公司，批號為F7EA83802）。

儀器：Aqualab 4TE Duo型水分活度測定儀（Decagon Devices公司，準確度為±0.003）；BJ-2202S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 g）；NU-534-400S型生物安全柜（Nuaire公司）；INC821C復合型低溫恒溫培養箱（Yamato公司）。

1.2 方法

培養基制備：以氯化鈉、甘油、蔗糖為調節劑，配制一系列不同Aw梯度的SDA培養基，滅菌，待培養基冷卻凝固，測量溫度為25℃時的Aw。參考USP＜1112＞表1[7］中黑根霉最低生長Aw，調節SDA培養基最高Aw為0.94，向下每個Aw梯度相差0.01。同時配制不加調節劑的SDA培養基作為對照組（control）。

孢子懸液制備與預培養：按2020年版《中國藥典（四部）》[16］要求，制備104cfu/mL的黑根霉孢子懸液。無菌操作，將濾膜正面朝上，貼于未調節Aw的SDA培養基上，取2.5μL孢子懸液點植于濾膜中心位置，22.5℃溫度下預培養24 h。

轉移及觀察：測量并記錄預培養后的菌落直徑，作為初始大小。將菌落連同濾膜轉移至制備好的不同梯度Aw的SDA培養基上，置用甘油調節的相同Aw環境的密閉容器中，22.5℃溫度下培養21 d，每天測量菌落直徑（垂直測量2次，取平均值），觀察并記錄菌落變化。以菌落直徑增長（mm）對培養時間（d）作線性圖，繪制黑根霉菌落生長曲線。

2 結果

2.1 黑根霉最低生長Aw

黑根霉在氯化鈉、甘油、蔗糖調節的不同Aw條件下的生長曲線見圖1。氯化鈉組，Aw＜0.93時黑根霉無生長跡象；Aw=0.94，0.93時，培養1 d菌落直徑有小幅度增加，可能原因是濾膜轉移時帶有少量原培養基，為黑根霉生長提供養分，故時間不能作為該Aw條件下的開始生長時間。菌落直徑自第2天停止增長，持續一段時間后再繼續增長，此時黑根霉生長養分來源為轉移后的培養基，為該Aw條件下的開始生長時間。甘油組與蔗糖組，在Aw較低時，黑根霉由原菌落中心部位開始生長，并非由原菌落菌絲直接向外擴張，故生長早期菌落直徑無變化。甘油組，Aw＜0.87時黑根霉無生長跡象。蔗糖組，Aw＜0.86時黑根霉無生長跡象；Aw=0.87，0.86時，肉眼可見有生長活動，但生長菌落未超過原有菌落范圍，故直徑增長計為0（圖2）。由此得到不同調節劑作用下黑根霉最低生長Aw，氯化鈉組為0.93，甘油組為0.87，蔗糖組為0.86。與氯化鈉相比，以甘油和蔗糖作為調節劑時，黑根霉可在更低Aw條件下生長。

2.2 Aw對黑根霉生長的影響

高于最低生長Aw的條件下，黑根霉經過一段時間的停滯期后，菌落直徑基本呈直線增長，直至長滿培養皿或試驗結束。以開始生長時間（d）、產孢時間（d）、生長速率（mm/d）為指標，評價Aw對黑根霉生長的影響。黑根霉不同Aw條件下的開始生長時間及產孢時間見表1。可見，隨著Aw的下降，黑根霉開始生長時間、產孢時間均推遲；Aw較高時，黑根霉通常于開始生長后第2～3天產孢；Aw越低，產孢時間較開始生長時間推遲越多，Aw低于一定程度時黑根霉不能產孢。甘油作為調節劑時，Aw＜0.89時黑根霉不能產孢；蔗糖作為調節劑時，Aw＜0.88黑根霉不能產孢。

表1 不同Aw條件下黑根霉開始生長時間和產孢時間Tab.1 Beginning growth time and sporulation time of Rhizopus nigricans under different Aw

取生長曲線開始生長后的部分進行線性擬合，所得斜率即為該生長條件下黑根霉的生長速率（mm/d）。由圖3可見，氯化鈉組生長速率在7～63 mm/d之間，甘油組與蔗糖組生長速率在1～63 mm/d之間。不同調節劑作用下、Aw對生長速率的影響基本一致，隨Aw的降低而下降。氯化鈉組和甘油組Aw與生長速率大致呈線性關系。蔗糖組在Aw=0.91時曲線出現明顯拐點，Aw＜0.91時Aw對黑根霉生長速率的影響減弱。

圖3 Aw對黑根霉生長速率的影響Fig.3 Effect of Aw on the growth rate of Rhizopus nigricans

3 討論

圖1及圖3顯示，隨著Aw的降低，黑根霉開始生長時間、產孢時間均推遲，生長速率下降；黑根霉在不同調節劑作用下最低生長Aw分別為0.93（氯化鈉）、0.87（甘油）、0.86（蔗糖），差異明顯。其中，氯化鈉組結果與USP＜1112＞結果一致，甘油組及蔗糖組結果更低。

USP＜1112＞結果源自1949年SNOW[13］的研究，其研究對象為環境分離菌株，培養基為浸泡過啤酒麥芽汁的明膠，干燥后接種黑根霉孢子，置用硫酸溶液調節的不同濕度的25℃密閉環境中培養，顯微鏡下觀察孢子的萌發情況。與本研究中所使用的判斷是否生長的標準及調節Aw的方式有區別。

2011年，AMIRI等[15］報道了在使用氯化鈉調節培養基Aw的條件下，黑根霉孢子萌發所需Aw（最低為0.908）低于菌絲生長Aw（最低為0.936），與本研究中氯化鈉組的結果一致。HOCKING等[14］使用葡萄糖和果糖調節培養基Aw，得到的黑根霉孢子萌發最低Aw為0.84。考慮菌絲萌發需要Aw環境更高，認為與本研究中蔗糖組的結果基本一致。

SNOW[13］通過調節環境濕度來調節Aw的方式，在實際產品生產及儲存過程中需要較長的平衡過程。在食品及制藥工業中，通常通過控制處方及工藝調節產品Aw，本研究中采用直接添加調節劑至培養基中，更貼近產品生產及儲存的實際情況，對于控制黑根霉污染、防止產品腐爛變質更有參考意義。且Aw調節劑種類對黑根霉生長有較大影響，提醒生產企業在選擇添加不同種類的Aw調節劑時應設定不同Aw標準，以更有效地降低藥品微生物污染風險。