高效液相色譜法檢測對乙酰氨基酚片中有關物質*

肖 江，王 輝，帥海濤，章澤恒，黃致遠

（1.湖南省藥用輔料工程技術研究中心有限公司，湖南 長沙 410331；2.國家藥用輔料工程技術研究中心，湖南 長沙 410331；3.湖南省藥品審評認證與不良反應監(jiān)測中心，湖南 長沙 410013）

對乙酰氨基酚又稱撲熱息痛，化學名為4'-羥基乙酰苯胺，為乙酰苯胺類解熱鎮(zhèn)痛藥，臨床廣泛用于治療各種輕、中度疼痛及兒童的發(fā)熱疾病[1-4］。對乙酰氨基酚于1878年在約翰·霍普金斯大學首次合成，1951年在美國獲批上市，1955年成為非處方藥，并成為世界上應用最廣的解熱鎮(zhèn)痛藥。我國最早于1960年開始生產[5］。目前，2020年版《中國藥典》[6］、《歐洲藥典》10.0版[7］和《美國藥典》40版[8］均收載了對乙酰氨基酚的有關物質檢查方法，除對氨基酚與對氯苯乙酰胺采用外標法測定外，其他雜質均采用不加校正因子的主成分自身對照法測定。根據對乙酰氨基酚的合成工藝推測，原料藥中潛在的雜質有雜質A-I和雜質L-N，均含有基因毒性雜質的潛在結構[9］。雜質L-N為《歐洲藥典》10.0版中新增雜質[8，10］，雜質L由苯酚氯代產生的副產物雜質C與對乙酰氨基酚聚合而成，雜質M和雜質N分別為對氨基酚和對乙酰氨基酚在酸性高溫條件下形成的聚合物。對氨基酚和對氯苯乙酰胺均為毒性雜質，具有潛在的基因毒性[11-12］。目前，關于乙酰氨基酚原料藥及制劑有關物質的研究多為對氨基酚、對氯苯乙酰胺、雜質A、雜質B、雜質D、雜質F，對大部分潛在雜質未開展系統(tǒng)性研究，且對國內制劑的質量也未進行考察[11-17］。本研究中在各國藥典方法的基礎上建立了一種帶校正因子的主成分自身對照法，對國內多個廠家的對乙酰氨基酚片與參比制劑進行了雜質對比研究，并根據2020年版《中國藥典（四部）》[18］和國際人用藥品注冊技術協(xié)調會（ICH）指導原則Validation of Analytical Procedures：Text and Methodology Q2（R1）進行了全面的方法學考察。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配有紫外檢測器；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200W，頻率為40kHz）；Milli-Q型超純水制水機（德國默克密理博公司）。

1.2 試藥

對乙酰氨基酚片（12批，規(guī)格均為每片0.5 g），樣品信息及生產廠家見表1；有關物質對照品信息見表2（雜質A-I和雜質L-N由TLC Pharmaceutical Standards公司提供；對氨基酚，對氯苯乙酰胺，對乙酰氨基酚由中國食品藥品檢定研究院提供）；冰醋酸（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；水為超純水。

表1 對乙酰氨基酚片樣品信息及生產廠家Tab.1 Information and manufacturers of Paracetamol Tablets samples

表2 有關物質對照品信息Tab.2 Information of references of related substances

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%冰醋酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（程序見表3）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：5μL。在此色譜條件下的系統(tǒng)適用性試驗結果見表4。

表3 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.3 Program of gradient elution of mobile phase（%）

表4 系統(tǒng)適用性試驗結果Tab.4 Results of the system suitability test

2.2 溶液制備

取甲醇150 mL，加水850 mL，混勻，作為稀釋劑。

取對乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細粉適量（相當于對乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容，振搖使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

取供試品溶液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置20 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得自身對照溶液。

取有關物質對氨基酚、對氯苯乙酰胺、雜質A-I和雜質L-N對照品各適量，精密稱定，加稀釋劑制成質量濃度為0.5 mg/mL的混合對照品貯備液。取混合對照品貯備液1.0 mL，置100 mL容量瓶中，加稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

取對氨基酚對照品5 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置100 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得對氨基酚對照品溶液。

取對氯苯乙酰胺對照品溶液5 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，用稀釋劑稀釋并定容；取1.0 mL，置200 mL容量瓶中，再次用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，即得對氯苯乙酰胺對照品溶液。

2.3 測定方法

精密量取2.2項下供試品溶液與各對照品溶液適量，分別注入高效液相色譜儀，按外標法以峰面積計算對氨基酚與對氯苯乙酰胺的含量，以加校正因子的自身對照法計算其他雜質的含量。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下供試品溶液和混合對照品溶液各適量，置同一容量瓶中，混勻，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。可見，對乙酰氨基酚色譜峰與各有關物質色譜峰均能達到基線分離，且分離度良好。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關系考察與相對校正因子：取對乙酰氨基酚和有關物質對照品各適量，精密稱定，配制系列質量濃度的標準曲線溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、各成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，并按主成分線性方程的斜率比各雜質線性方程的斜率計算相對校正因子。結果見表5。

定量限與檢測限確定：取2.2項下稀釋劑，待儀器平衡后注入色譜儀，連續(xù)進樣3次，記錄基線噪音，根據系統(tǒng)適用性試驗中各雜質的峰高逐級稀釋，至信噪比（S/N）分別為10±1和3±1，得到各雜質的定量限和檢測限。結果見表5。

表5 方法學考察結果與相對校正因子Tab.5 Results of the methodological investigation and RCFs

中間精密度試驗：在同一實驗室，由不同實驗員在不同日期進行重復性試驗。結果的RSD均小于4.0%，表明方法中間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品溶液與混合對照品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果供試品溶液與混合對照品溶液中各有關物質峰面積的RSD均小于3.0%（n=5），表明供試品溶液與對照品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

重復性試驗：取對乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細粉適量（相當于對乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入2.2項下混合對照品貯備液1.0 mL，用稀釋劑稀釋并定容，振搖，濾過，取續(xù)濾液，平行6份，按2.1項下色譜條件分別進樣測定，按2.3項下方法計算。結果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取對乙酰氨基酚片，研磨成粉，取細粉適量（相當于對乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，共9份，置10 mL容量瓶中，分別加入80%，100%，120%限度的雜質A-I、雜質L-N、對氨基酚、對氯苯乙酰胺對照品，各3份，用稀釋劑稀釋并定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表5。

破壞試驗：取2.2項下供試品溶液，在酸（1 mol/L鹽酸溶液2 mL破壞2 h）、堿（1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL破壞2 h）、高溫（90℃水浴破壞2 h）、氧化（30%過氧化氫溶液2 mL破壞2 h）及光照（4 500 lx破壞2 h）條件下進行強制降解試驗。結果對乙酰氨基酚在酸、堿、氧化及光照條件下，降解過程中均未產生新的雜質；高溫條件下降解產生了新的雜質，各雜質峰均基線分離，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖1.Paracetamol 2.Impurity B 3.Unknown impurity 4.Impurity G 5.Impurity H a.Destroyed by high temperature b.No destroying c.Destroyed by acid d.Destroyed by alkali e.Destroyed by oxidation f.Destroyed by lightFig.2 HPLC chromatograms of the destructive test

耐用性試驗：取2.2項下供試品溶液與混合對照品溶液各適量，分別考察不同批次色譜柱，不同柱溫（25，30，35℃），不同流速（0.7，0.8，0.9 mL/min）和不同檢測波長（250，254，258 nm）條件下各有關物質的分離度。結果各有關物質色譜峰的分離度均大于1.5，含量的RSD均小于4.0%，表明方法耐用性良好。

2.5 樣品有關物質含量測定

取12批（編號為Ⅰ-Ⅻ）樣品各適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，按2.3項下方法計算各樣品中有關物質的含量。結果12批不同廠家的樣品中14個有關物質含量為0.008 0%～0.070 4%。對乙酰氨基酚片參比制劑（編號為Ⅰ）中檢出雜質B與雜質H；國內11批（編號為Ⅱ-Ⅻ）對乙酰氨基酚片中檢出對氨基酚、雜質A-D、雜質F、雜質H、雜質L、雜質N，均未檢出對氯苯乙酰胺、雜質E、雜質G、雜質I、雜質M。詳見表6。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

《歐洲藥典》10.0版中關于對乙酰氨基酚有關物質的分析較全面，但以HALO-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7μm）為色譜柱時雜質A與雜質B未能完全分離。由于色譜柱內徑及粒徑較小，液相色譜儀的柱壓較高，長期使用會對儀器造成不良影響，且色譜柱的使用壽命不佳。調整色譜柱為Xbridge-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為純化水-甲醇，但僅能分離13個雜質，且對氨基酚與對乙酰氨基酚的色譜峰峰形稍有拖尾，影響樣品測定的準確性。最終將流動相調整為0.1%冰醋酸水溶液-甲醇，分離效果良好。

3.2 測定和計算方法選擇

除對氨基酚與對氯苯乙酰胺外，國內外藥典均采用自身對照法測定其他雜質的含量。但雜質A-F、雜質H-I、雜質L-M的相對校正因子分別為1.15，1.27，1.26，1.48，2.79，1.24，1.33，1.27，1.84，2.13，均不在0.9～1.1范圍內，應采用更合理的帶相對校正因子的自身對照法進行檢測和計算，以保障雜質檢測的準確性。

3.3 雜質限度確認

2020年版《中國藥典》、《歐洲藥典》10.0版和《美國藥典》40版中均有收載對乙酰氨基酚有關物質的檢測，其中《歐洲藥典》10.0版中有關物質限度最嚴格。由表6可知，12家企業(yè)的對乙酰氨基酚片中的有關物質的含量均未超標。參照《歐洲藥典》10.0版制訂對乙酰氨基酚片有關物質限度，即對氨基酚不得過0.005%，對氯苯乙酰胺不得過0.001%，雜質A-I與雜質L-N均不得過0.05%，總雜質不得過0.2%。

3.4 樣品中雜質來源分析

由于對乙酰氨基酚一般以對硝基苯酚為原料，還原為對氨基苯酚后經乙酰化制得，其中對硝基苯酚由氯苯經硝化反應制得。由表6可知，對乙酰氨基酚片中有關物質檢出量大于0.01%的雜質主要為雜質A、雜質B、雜質C、雜質H。其中，雜質A為對硝基苯酚原料中鄰硝基苯酚導致的雜質，雜質B為丙酰化雜質，雜質C由對硝基氯苯原料氯苯中的鄰二氯苯引入，雜質H為對氨基苯酚過度乙酰化產生。樣品（編號Ⅰ）為仿制藥一致性評價的參比制劑，其雜質含量明顯低于國內大部分制劑。可見，對乙酰氨基酚片中有關物質主要來源于原料藥合成過程中引入的雜質，并非由存儲環(huán)境或輔料導致，故應從源頭對原料藥的質量進行控制，以提升制劑的質量。

3.5 方法評價

本研究中建立了有效檢測對乙酰氨基酚片中有關物質的高效液相色譜法，方法專屬性強、靈敏度和準確度均高，可有效分離14種有關物質及主成分；并考察了市售對乙酰氨基酚片及仿制藥一致性評價參比制劑的有關物質，可為相關生產廠家及檢驗機構提供參考，有助于提升國內對乙酰氨基酚片的質量。