L9（34）正交試驗法優選黃芩解毒顆粒水提取工藝*

羅朝亮，韋開聽，龍立活，陸治宇，周賢強，張 浩，吳芳芳△，陳 路

（1.廣西壯族自治區藥用植物園·西南瀕危藥材資源開發國家工程實驗室，廣西 南寧 530023；2.廣西壯要方醫院，廣西 南寧 530150）

五味消毒飲出自《醫宗金鑒·外科心法要訣》卷七十二方，由金銀花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子、野菊花組方[1］，具有清熱解毒、消散疔瘡之功效，消癰散結之功偏重，主治熱毒蘊蒸肌膚所致疔瘡癰腫。廣西壯要方醫院對五味消毒飲原處方進行了加減，增加黃芩清熱燥濕、穿心蓮瀉火解毒、梔子涼血消癰，減去紫花地丁、紫背天葵子，最終形成了由黃芩、山銀花、穿心蓮、蒲公英、野菊花、梔子6味藥材組方的黃芩解毒顆粒，旨在提升其清熱、涼血、解毒之功效，治療風熱感冒的療效良好。為保證改良后處方的質量和療效，提高制劑的安全性與可控性，本研究中對黃芩解毒顆粒的制劑工藝進行了優化，為該制劑的進一步開發與利用提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210型高效液相色譜儀（美國瓦里安公司）；BSA124S型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度為萬分之一）；SB-5200D型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，功率200 W，頻率40 kHz）；ZF-8型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110715-201821，含量以95.4 %計）；黃芩（產地山西，批號為20180902），山銀花（產地湖南，批號為20190401），穿心蓮（產地廣西，批號為20190501），蒲公英（產地湖北，批號為20181201），野菊花（產地湖北，批號為20180701），梔子（產地江西，批號為20180801），均購于廣西仙茱中藥科技有限公司，經廣西壯族自治區藥用植物園藍鳴生主任藥師鑒定為正品；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件[2-7］與系統適用性試驗

色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（48∶52∶0.1，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。理論板數按黃芩苷峰計應不低于5 000。

2.1.2 溶液制備

取黃芩苷對照品0.025 5 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液（質量濃度為0.243 3 mg/mL）；精密量取對照品貯備液5 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，即得黃芩苷對照品溶液（質量濃度為0.121 7 mg/mL）。分別取正交試驗項下黃芩解毒顆粒浸膏樣品各0.2 g，精密稱定，共9份，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取除去黃芩以外的其他藥材，按優選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取2.1.2項下3種溶液各10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。結果黃芩苷色譜峰分離效果良好，且陰性對照品溶液在相同保留時間處無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Baicalin A.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密量取2.1.2項下對照品貯備液1，2，3，4，5，6，7，8 mL，分別置10 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋并定容，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=33.46X+2.279 7，r=0.999 7（n=8）。結果表明，黃芩苷進樣量在0.243～1.946μg范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限與定量限確定：取2.1.2項下黃芩苷對照品溶液，用50%甲醇逐級稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1時的進樣量計算檢測限和定量限。結果黃芩苷的檢測限為7.5 ng，定量限為22.4 ng。

精密度試驗：取2.1.2項下黃芩苷對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件在1 d內重復進樣6次，考察日內精密度；連續3 d重復進樣6次，考察日間精密度，并記錄峰面積。結果日內精密度RSD為0.79%（n=6），日間精密度RSD為1.25%（n=18），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品1 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，1，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果黃芩苷峰面積的RSD為1.63%（n=7），表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批樣品1 g，精密稱定，共6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD為1.82%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取黃芩苷對照品0.039 3 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，作為對照品貯備液（質量濃度為0.374 9 mg/mL）；取已知黃芩苷含量的樣品0.5 g，精密稱定，共9份，依次精密加入上述黃芩苷對照品貯備液3，6，9 mL，各3份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 黃芩苷加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of baicalin（n=9）

2.1.4 樣品含量測定

精密吸取2.1.2項下對照品溶液和供試品溶液各10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算黃芩苷含量。

2.2 干膏得率測定

取樣品水提濃縮稠膏適量，精密稱定，置已干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，轉移至烘箱，以105℃干燥至恒定質量，取出，置干燥器中冷卻30 min，精密稱定質量，按公式[干膏得率（%）=（干膏質量×稠膏總質量）/（藥材飲片質量×取樣量）×100%］計算。

2.3 單因素試驗[8-9］

加水量：按處方稱取藥材5份，分別按藥材量的6倍、8倍、10倍、12倍、14倍加水，置鍋中煎煮1.0 h，濾過，水浴蒸發濃縮成浸膏。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，測定黃芩苷回收率和干膏得率。結果見圖2 A。可見，加入藥材8倍、10倍、12倍量水時，藥材干浸膏得膏和黃芩苷回收率均較高，且從8倍量起增加趨于平緩。故加水量選擇加入8倍、10倍、12倍進行正交試驗。

煎煮時間：按處方稱取藥材5份，分別加入8倍量水，煎煮提取1次，煎煮時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，濾過，水浴蒸發濃縮成浸膏。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，測定黃芩苷回收率和干膏得率，結果見圖2 B。可見，煎煮時間為1.0 h時，黃芩苷回收率和干膏得率均最大。故煎煮時間選擇0.5，1.0，1.5 h進行正交試驗。

煎煮次數：按處方稱取藥材5份，分別加入8倍量水，煎煮1.0 h，分別煎煮1次、2次、3次、4次，濾過，合并濾液，水浴蒸發濃縮成浸膏。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，測定黃芩苷回收率和干膏得率，結果見圖2 C。可見，煎煮2次后，黃芩苷回收率趨于平緩甚至下降，干膏得率逐漸增大。故煎煮次數選擇1次、2次、3次進行正交試驗。

圖2 單因素試驗優選黃芩解毒顆粒水提取工藝A.Amount of water addition B.Decocting time C.Decocting timesFig.2 Optimization of water extraction process of Huangqin Jiedu Granules by the single factor test

2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，以干膏得率和黃芩苷回收率為評價指標，以加水量（因素A）、煎煮時間（因素B）、煎煮次數（因素C）為考察因素進行正交試驗，每個因素設3個水平，采用L9（34）正交試驗表進行試驗，因素與水平見表2。按制劑處方比例稱取黃芩解毒顆粒方藥材飲片280 g，其中黃芩50 g，山銀花35 g，穿心蓮50 g，蒲公英50 g，野菊花45 g，梔子50 g，共9份，按正交試驗表進行設計與試驗。結果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

由表3極差分析可知，以干膏得率為評價指標時，影響因素由大至小為煎煮時間（因素B）＞煎煮次數（因素C）＞加水量（因素A），且B2，C2，A2最佳，但A1與A2的差異不大；以黃芩苷回收率為評價指標時，影響因素由大至小為煎煮時間（因素B）＞煎煮次數（因素C）＞加水量（因素A），且B2，C2，A1最佳。采用SPSS 23.0統計學軟件對正交試驗結果進行方差分析，以P＜0.05為對結果有顯著影響，結果見表4。可見，以干膏得率為評價指標時，煎煮時間（因素B）為顯著影響因素（P＜0.05），而加水量、煎煮次數均為無顯著影響因素（P＞0.05）；以黃芩苷回收率為評價指標時，加水量、煎煮時間、煎煮次數均為無顯著影響因素（P＞0.05）。綜合考慮成本和提取效率，確定最佳工藝為A1B2C2，即加8倍量水，煎煮2次，每次1.0 h，濾過，水浴蒸發，濃縮成稠膏。

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA

2.5 驗證試驗

按制劑處方比例稱取黃芩解毒顆粒處方藥材飲片280 g，各3份，按優選的最佳工藝進行煎煮，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，計算干膏得率和黃芩苷回收率。結果見表5。可見，干膏得率和指標性成分黃芩苷回收率高且穩定，表明優選工藝合理、可行。

表5 最佳提取工藝驗證試驗結果（%，n=3）Tab.5 Results of the verification test of the optimal extraction process（%，n=3）

3 討論

3.1 評價指標選擇

五味消毒飲為中醫常用方劑，其方劑及加減方廣泛應用于治療眼科早期瞼腺炎[10］、外科急性關節炎[11］、痤瘡[12］、濕疹[13］等疾病，卻鮮見報道治療風熱感冒等發熱性疾病。廣西壯要方醫院以廣西壯藥[14］應用為理論基礎，通過辨證論治，對五味消毒飲進行加減而創制黃芩解毒顆粒。方中，黃芩為君藥，味苦，性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血等功效[15］。評價指標的選擇是本研究的關鍵步驟之一。黃芩為君藥，起主要治療作用。黃芩苷為黃芩的主要活性成分，具有抑菌、抗炎、抗過敏等藥理作用[16-18］，與本方專用于治療熱毒侵襲引發的風熱感冒一致。考慮本方為復方中藥制劑，藥效物質基礎為多成分共同作用，故選擇黃芩苷回收率和干膏得率為評價指標。

3.2 色譜條件選擇

方法學考察關系到試驗數據的可靠性，由于黃芩解毒顆粒為新創制劑，相關研究較少，系統參數確定困難。曾考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸等多個流動相系統，色譜峰峰形和分離度均不理想，最終采用甲醇-水-磷酸（48∶52∶0.1，V/V/V）作為流動相的效果較好；曾考察不同品牌色譜柱[Kromasil 100-5 C18柱、Agilent Eclipse XDB C18柱、Diamomsil C18柱，（250 mm×4.6 mm，5μm）］，結果色譜峰峰形和分離度均符合要求。

3.3 水提取工藝方法評價

正交試驗設計常用于優化生產工藝，本研究中采用L9（34）正交試驗確定了黃芩解毒顆粒的最佳水提取工藝，操作簡便、指標成分含量高，可用于規模化生產。黃芩解毒顆粒提取工藝的初步研究可為該制劑質量控制提供依據，為進一步開發奠定基礎。