缺氧誘導因子-1α、Notch1和Jagged1共轉染對急性心肌梗死模型大鼠心功能的改善作用

李雪梅，南武娟

(1.榆林市第一醫院心血管內科，陜西 榆林 719000；2.咸陽市第一人民醫院急診醫學科，陜西 咸陽 712000)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)指心肌缺血導致心肌細胞凋亡和壞死，進而導致心肌缺氧，最終導致心功能受損[1-3]。AMI是所有類型心血管疾病的主要死因，因此探索心肌梗死后缺氧調節心肌細胞凋亡的機制可能為深入了解和預防心肌細胞凋亡提供重要的分子基礎。心肌缺血/再灌注可激活保護心肌細胞免受缺血性損傷的各種分子和細胞途徑[4-5]。在這些信號通路中，Notch信號傳導是一種重要的模式識別受體，與骨髓分化、炎癥和平滑肌細胞增殖密切相關，并且與動脈粥樣硬化、糖尿病和其他代謝疾病等有關[6]。在典型的信號通路中，Notch受體與其配體(Delta-like或Jagged)相互作用導致跨膜Notch受體的蛋白水解切割，產生Notch細胞內結構域，遷移到細胞核中。在細胞核中，細胞內結構域與轉錄因子重組信號結合蛋白J結合并調節轉錄。Jagged1是Notch信號通路重要的配體，是一種在血管內皮細胞、平滑肌細胞中表達的特異性單次細胞跨膜蛋白，具有修復神經元、促進其再生的作用，進而提高神經元的存活率。Notch信號使巨噬細胞向M1促炎表型極化并增強炎性反應。此外，Notch信號傳導可能通過發狀分裂相關增強子1(Hairy and enhancer of split 1，Hes1)/信號轉導及轉錄激活因子3通路的激活子激活缺氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)基因。HIF-1α在缺氧期間調節一系列基因的表達水平，并在調節細胞功能中發揮雙向作用[7]。HIF-1α是心肌梗死后缺氧反應的主要調節劑，在調節氧穩態中起關鍵作用，通過減少氧氣或增加氧化應激激活 HIF-1α，在心肌中發揮心臟保護作用[8]。本研究探討急性心肌梗死模型大鼠外周血缺氧誘導因子-1α、Notch1和Jagged1表達水平與心功能的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠30只，鼠齡2～3個月，平均體重(250±30)g，購自陜西省疾病預防控制中心，許可證號：XYXK(陜)2018-009。將大鼠飼養在(22±2)°C、40%～50%濕度、12 h/12 h光/暗循環、自由獲取食物和水的環境中。

1.2 主要試劑與儀器 1%戊巴比妥鈉(批號：P3761，德國Sigma-Aldrich公司)；4%多聚甲醛(批號：47608，德國Sigma-Aldrich公司)；TRIzol試劑(批號：5017511，美國Thermo Fisher公司)；PCR試劑盒(批號：4349182美國，Thermo Fisher公司)；增強型化學發光試劑(批號：WP20005，美國Thermo Fisher公司)；光學顯微鏡(型號：CH20BIMF200，日本東京奧林巴斯公司)。

1.3 實驗分組 將30只大鼠分為模型組、共轉染組和對照組，每組10只。①模型組：通過腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉對大鼠進行麻醉。氣管插管后，所有大鼠使用小動物呼吸機接受正壓有氧通氣，并在左側第4肋間打開胸部，切開心包后將心臟外化。使用6-0絲線縫合冠狀動脈左前降支，距主動脈根部約3～5 mm。通過梗死區域的局部發紺驗證AMI模型的制備成功。②共轉染組：在冠狀動脈左前降支結扎過程中將HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉染慢病毒注射到大鼠心臟的胸前組織中，即在梗死區域周圍的4個不同點注射慢病毒，每個點注射1×106個慢病毒轉導單位。③對照組：與模型組進行相同的外科手術，但不結扎冠狀動脈左前降支。

1.4 心肌組織HE染色 用40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹膜內注射麻醉大鼠，快速解剖心臟并用0.9%氯化鈉溶液沖洗，隨后使用充水球囊將左心室內壓維持在20 mmHg。移除主動脈弓、右心室、心房和耳廓，水平切成五個1 mm厚的部分。提取的左心室梗死區域在4%多聚甲醛中固定24 h。將固定的組織標本切成6 μm切片用于HE染色。在光學顯微鏡下以400倍放大率評估染色組織的形態學改變。

1.5 反轉錄定量PCR(RT-qPCR)分析 根據制造商的方案，用Trizol試劑從100 mg缺血心肌組織樣品中提取總RNA。RNA的純度用分光光度法測定A260/A280比值。每個樣品的總RNA(2 μg)用莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶合成cDNA。以下引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成：HIF-1α正向序列為5’-CAGCGATGACACGGAAAC-3’，反向序列序列為5’-AGTGACTCTGGGCTTGAC-3’；Notch1 正向序列為5’-CTTCGTGCTCCTGTTCTTTG-3’，反向序列為5’-GCCTCTGACACTTTGAAACC-3’；Jagged1正向序列為5’-CACCCGAACTGGACAAAC-3’，反向序列為5’-AGCCTCAGACTGGGATAC-3’。這些引物對分別產生210、105、170 bp的擴增產物。將大鼠甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內部對照：正向序列為5’-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，反向序列為5’-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3’。使用SYBR實時PCR試劑盒制備qPCR反應。通過檢測SYBR-Green 熒光信號強度對PCR產物進行定量，并通過Applied Biosystems Prism 7300 SDS軟件進行分析。HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達水平通過2-ΔΔCt法量化，歸一化為GAPDH水平。

1.6 蛋白印跡分析 將20 mg冷凍組織樣品粉碎并在150～250 μl RIPA裂解緩沖液中均質化。根據制造商的方案，通過進行BCA測定來確定蛋白質水平。制備的蛋白質樣品通過10% SDS-PAGE分離并轉移到硝酸纖維素膜上，將膜在室溫下用TBS中的奶粉封閉60 min，與抗HIF-1α(1∶1000)、抗Notch1(1∶1000)、抗Jagged1(1∶500)和抗GAPDH(1∶1500)一抗在4 ℃下孵育過夜后，用含0.1% Tween-20的TBS洗滌膜3次，隨后用含0.1% Tween-20的TBS中的HRP偶聯二抗(1∶2000)在37 ℃下孵育30 min。根據制造商的方案，使用增強型化學發光試劑使條帶可視化。將HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白質的相對表達水平標準化為來自同一樣品的GAPDH條帶的強度。所有實驗重復3次，并計算平均值。

1.7 心功能指標檢測 通過超聲心動圖和有創壓力-容積血流動力學評估心臟功能。超聲心動圖專家以盲法進行測量，檢測射血分數(EF)、左心室縮短分數(FS)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)和左心室收縮末期內徑(LVESD)。

2 結 果

2.1 三組大鼠心肌組織HE染色結果 見圖1。對照組大鼠心肌細胞膜完整，無炎癥細胞浸潤；模型組心肌細胞溶解或破壞、心肌結構紊亂、出現大量成纖維細胞或膠原纖維及少量炎癥細胞浸潤；共轉染組上述組織病理學異常較模型組減輕。

圖1 三組大鼠心肌組織HE染色結果(×400)

2.2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白相對表達水平比較 見圖2(表1)。模型組HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白相對表達水平較對照組降低，共轉染組HIF-1α、Notch1和Jagged1蛋白相對表達水平較模型組升高(均P<0.05)。

圖2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白電泳結果

表1 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1蛋白相對表達水平比較

2.3 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1 mRNA相對表達水平比較 見表2。模型組HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達水平較對照組降低，共轉染組HIF-1α、Notch1和Jagged1 mRNA相對表達水平較模型組升高(均P<0.05)。

表2 三組大鼠HIF-1α、Notch1、Jagged1 mRNA相對表達水平比較

2.4 三組大鼠心功能指標比較 見表3。模型組EF和FS較對照組降低，共轉染組EF和FS較模型組升高(均P<0.05)。模型組LVEDD和LVESD較對照組升高，共轉染組LVEDD和LVESD較模型組降低(均P<0.05)。

表3 三組大鼠心功能指標比較

3 討 論

AMI伴有心肌細胞凋亡、心肌重構等多種病理特征，心肌細胞凋亡是AMI后心肌損傷的主要原因。一系列病理因素可誘導心肌細胞凋亡，包括缺氧、鈣超載和酸中毒，其中缺氧是導致心肌細胞凋亡的重要因素[9-11]。在本研究中，通過冠狀動脈結扎建立大鼠AMI模型。HE染色觀察到梗死心臟組織學變化表現為心肌細胞溶解或破壞、心肌結構紊亂和大量成纖維細胞或膠原纖維，而HIF-1α、Notch1和Jagged1共轉染過表達顯著減輕了這些病理異常。

HI是一種核轉錄調節因子，由HIF-1α和HIF-1β組成[12-13]。研究表明，HIF-1α是一種表達發生變化的轉錄因子，在缺氧期間發揮重要作用。HIF-1α調節與糖酵解、糖代謝、線粒體功能、細胞存活相關的一系列基因的表達，以及細胞凋亡和抗氧化應激。具體來說，低劑量和高劑量的HIF-1α對缺氧后心肌細胞凋亡的影響不同。研究[14-16]表明，HIF-1α增強了對缺氧的耐受性并保護了心肌。隨著HIF-1α劑量的增加，HIF-1α介導的細胞功能調節可能導致更差的結果。AMI誘導缺血或缺氧心肌中HIF-1α的上調，這有助于心臟保護作用。在本研究中，與模型組大鼠相比，共轉染組增加了HIF-1α mRNA和蛋白的表達。動物實驗表明，HIF-1α過表達可減輕梗死面積并在梗死后4周改善心臟功能。因此，HIF-1α被認為是心臟保護的治療靶點。Notch信號傳導在免疫細胞中的作用也得到了廣泛的研究，特別是在巨噬細胞之間的近分泌同型通訊以及在各種缺血損傷模型中[17-18]。全身和局部巨噬細胞趨化性的增加導致Notch信號和巨噬細胞(M1)的激活，并延長炎癥細胞向傷口的募集。Notch信號通路對細胞增殖、分化和凋亡的調節至關重要。心肌中的低氧環境可能導致Notch信號激活，從而通過促進心肌再生、保護缺血心肌或誘導血管生成來減輕心肌損傷并改善心臟功能[19-20]。Notch1和Jagged1是在成人肌細胞中表達的主要Notch信號形式。此外，Notch1信號在增殖的胚胎和未成熟心肌細胞或梗死后心肌的邊界區中被激活[21]。Notch1信號傳導還抑制缺血后心肌細胞的凋亡[22]。本研究在AMI后檢測到心肌中Notch1和Jagged1的表達降低，與模型組大鼠相比，Notch1和Jagged1的模擬轉染物增加了Notch1和Jagged1 mRNA及蛋白的表達，表明Notch1/Jagged1信號傳導的上調可能是減輕AMI后心肌損傷的潛在機制。

本研究中使用動物超聲系統檢測大鼠的心功能并進行比較，結果發現：模型組EF和FS較對照組降低，共轉染組EF和FS較模型組升高；模型組LVEDD和LVESD較對照組升高，共轉染組LVEDD和LVESD較模型組降低。這表明HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉染減輕了模型組大鼠心功能的惡化，具有改善心功能的作用。

綜上所述，AMI模型大鼠外周血HIF-1α、Notch1、Jagged1表達水平降低，心功能下降。HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉染可改善AMI模型大鼠的心功能。