C1q壞死因子相關蛋白12、脂聯素在腦動脈粥樣硬化大鼠血清中的表達及其與磁共振成像技術參數相關性研究

宋 煒，徐曉軍，張學平

(1.陜西省康復醫院影像科,陜西 西安 710065;2.榆林市星元醫院磁共振室,陜西 榆林 719000)

顱內動脈粥樣硬化是指腦動脈的管壁由于脂類物質沉積和內膜受損，血小板、纖維素等物質聚集在損傷的內膜上，引起管壁結締組織增生、內膜粗糙、失去彈性以及管腔狹窄或閉塞，從而引起腦組織供血減少或梗死，是一種臨床上常見的腦血管疾病之一[1-2]。腦動脈粥樣硬化的發生與多種因素有關，包括年齡、飲食、性別、吸煙以及高血壓等。在我國，缺血性腦卒中約占腦卒中的74%，其中約46.6%的缺血性腦卒中是由顱內動脈粥樣硬化性狹窄而引起，所以腦動脈硬化斑塊的早期檢出和穩定性判斷對預防和治療腦卒中意義重大[3-4]。磁共振成像技術是一種無創的、可有效評估患者血管壁和動脈斑塊穩定性的影像學診斷技術，但高昂的價格使其不能被廣泛的應用于腦動脈粥樣硬化患者的斑塊評估中[5]。C1q壞死因子相關蛋白12(C1q necrosis factor-related protein 12，CTRP12)是一種新發現的脂肪因子，是脂聯素保守的旁系同源物。研究[6-7]表明，CTRP12主要參與脂肪細胞合成和分泌，具有廣泛的生物學作用，包括抗炎和抑制甘油三酯合成等，被發現可以通過miR-155-5p/LXRα 通路促進膽固醇流出和抑制炎性反應來改善動脈粥樣硬化。脂聯素(Adiponectin，APN) 是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性多肽或蛋白質。此外，脂聯素也是一種胰島素增敏激素能改善小鼠的胰島素抗性和動脈硬化癥，并被證實與2型糖尿病和冠心病的發展有關，在臨床試驗表現出抗糖尿病、抗動脈粥樣和炎癥的潛力[8]。本研究通過高脂飲食喂養高血壓大鼠以建立腦動脈粥樣硬化模型，研究腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN的表達水平，并探討其表達與磁共振成像技術參數的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗大鼠：30只SD大鼠(6～8周齡，SPF級，雌性，300 g左右)斯貝福(北京)生物技術有限公司[實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2022-0075]。所有大鼠被適應性喂養1周(自由進食飲水，晝夜各半，22 ℃)后被用于本研究。

1.1.2 試劑與儀器：基礎飼料和高脂飼料均購買自北京博奧派克生物科技有限公司；CTRP12酶聯免疫試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司(批號202010)；脂聯素(APN)酶聯免疫試劑盒購自Merck公司(批號RAB1136)；小動物核磁共振成像儀購自蘇州紐邁分析儀器股份有限公司(型號NM21-040H-I)。

1.2 研究方法

1.2.1 腦動脈粥樣硬化模型制作：參考文獻[9]建立高血壓、高血脂誘導的腦動脈粥樣硬化大鼠模型。兩組大鼠均禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉后，在無菌條件下切開腹部皮膚，分離雙側腎動脈，使用手術縫合線以適度的松緊度結扎雙側腎動脈(血液可流動)，造成雙側腎動脈狹窄，即建立高血壓模型。正常大鼠血壓為85～115 mmHg，造模后血壓若≥正常血壓20 mmHg且>115 mmHg說明高血壓模型制作成功。對照組大鼠僅開腹不結扎雙側腎動脈。術后模型組大鼠給予高脂飼料喂養，而對照組大鼠給予普通飼料喂養，共喂養16周。高脂飼料可造成大鼠高血脂，進而誘導動脈粥樣硬化，在高血壓基礎上，可加速腦動脈粥樣硬化形成。當觀察到大鼠血管內皮表面粗糙、凹凸不平，細胞排列不齊，內膜的平滑肌細胞增生明顯，且與大量堆積的泡沫細胞形成典型的動脈粥樣硬化斑塊，說明腦動脈粥樣硬化大鼠模型造模成功。

1.2.2 頭顱磁共振掃描：模型組在術后喂養16后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，使用核磁共振成像儀對所有大鼠大腦中動脈進行整體掃描，將掃描數據上傳工作站，并在3D-TOF 原始圖及重建圖上確定動脈狹窄位置，依此使用軟件直接計算大鼠腦動脈斑塊個數、斑塊厚度和斑塊體積。

1.2.3 血清學指標：大鼠在完成頭顱磁共振成像掃描后，通過頸椎脫臼法處理所有大鼠，手術切開胸腔，暴露心臟，使用無菌注射器吸取血液3～5 ml，室溫條件下1000 g離心10 min以分離血清，使用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇含量，并使用酶聯免疫吸附法檢測血清CTRP12和APN水平。

1.2.4 血壓測量：于術前、術后1周將清醒狀態的大鼠置于固定器內，露出鼠尾，于37 ℃水中浸泡30 min，將鼠尾放進套袖，待大鼠安靜后充氣，測定收縮壓，重復3次取平均值。

2 結 果

2.1 兩組大鼠血壓和血脂水平比較 模型組大鼠收縮壓和血清總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著高于對照組大鼠(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠收縮壓和血脂指標比較

2.2 兩組大鼠血清CTRP12和APN水平比較 模型組大鼠血清CTRP12和APN水平均顯著低于對照組正常大鼠(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠血清CTRP12和APN水平比較

2.3 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊個數相關性 應用磁共振成像技術檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊個數，并分析其與血清CTRP12和APN相關性，結果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊個數與CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.692，P<0.05)水平呈顯著負相關，見圖1。

圖1 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊個數與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關性散點圖

2.4 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊厚度相關性 應用磁共振成像技術檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊厚度，并分析其與血清CTRP12和APN相關性，結果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊厚度與CTRP12(r=-0.622，P<0.05)、APN(r=-0.577，P<0.05)水平呈顯著負相關，見圖2。

圖2 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊厚度與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關性散點圖

2.5 血清CTRP12、APN水平與腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊體積相關性 應用磁共振成像技術檢測15只腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊體積，并分析其與血清CTRP12和APN相關性，結果顯示：腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈內斑塊體積與CTRP12(r=-0.732，P<0.05)、APN(r=-0.612，P<0.05)水平呈顯著負相關，見圖3。

圖3 腦動脈粥樣硬化大鼠斑塊體積與血清CTRP12 (左)、APN (右)水平相關性散點圖

3 討 論

顱內動脈粥樣硬化性狹窄(Intracranial atherosclerotic stenosis，ICAS)不僅是缺血性卒中(中風)最常見原因之一，同樣也是卒中復發的高風險因素，當前呈現出高發病率及高病死率的特點。流行病學統計數據[10-11]顯示，超過一半的東南亞缺血性腦卒中是由ICAS引起，并且ICAS患者不僅終生卒中發病風險升高，而且1年內再發卒中概率可高達20%。此外，研究[12]還指出，無論是癥狀性ICAS還是無癥狀ICAS患者，血管風險因素均與其狹窄嚴重程度、卒中發病風險呈現明顯相關性，因此對血管風險因素進行有效管理至關重要。盡管目前多種影像學技術，比如彩超、CT血管造影、數字減影血管造影以及磁共振血管成像等，都可以有效地對血管壁狀態和斑塊穩定性進行評估，但較高的成本使其不能被推廣。因此，篩選出與動脈血管壁狀態和斑塊穩定性有關的生物標志物意義重大。

本文研究發現，模型組腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN水平均顯著低于對照組正常大鼠，這表明血清CTRP12和APN可能與腦動脈粥樣硬化的發生發展有關。進一步分析可知：脂肪因子是由脂肪組織分泌的具有生物活性的細胞因子及激素，與胰島素抵抗冠狀動脈粥樣硬化等代謝過程密切相關，CTRP12和APN都是脂肪因子[13]。脂聯素是外周血中含量最高的脂肪因子，通過與其受體結合后，通過激活腺苷酸活化蛋白激酶、p38絲裂原活化蛋白激酶和過氧物酶體增殖物激活受體等信號分子發揮抗炎、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化等多種生物學作用[14]。CTRP12作為脂聯素的旁系同源物，由信號肽、短N端結構域、膠原樣結構域和球狀C1q樣結構域組成。與脂聯素一樣，CTRP12也被發現與動脈粥樣硬化的發生發展有關，并被發現在與炎性細胞因子和胰島素抵抗有關的冠狀動脈疾病患者血清中表達降低[15-16]。綜上并結合本研究結果可知，CTRP12和APN在腦動脈粥樣硬化大鼠血清中表達降低，并可能與腦動脈粥樣硬化的發展有關。

高分辨磁共振成像(High-resolution magnetic resonance imaging，HRMRI)是當前明確動脈粥樣硬化斑塊性質最為可靠的無創檢查之一，其可以清晰地看到血管壁的情況，尤其對于硬化斑塊的形態及組織成分的分析有著較大的優勢[17]。此外，HRMRI不僅可以評判出斑塊的性質，而且可以判斷出斑塊分型，并且可以顯示斑塊形態、斑塊體積，可以分析斑塊性質、斑塊纖維帽、脂質核心大小、斑塊鈣化、斑塊內出血[18-19]。雖然高分辨磁共振成像能較準確地分析斑塊的內部組成，是目前判定斑塊性質最好的無創檢查，但是高分辨磁共振成像對于設備要求較高、檢查時間長、價格較為昂貴，這限制了它在臨床上的普及。本研究發現，血清CTRP12、APN與磁共振成像技術確定的腦動脈粥樣硬化大鼠腦動脈斑塊個數、厚度和體積均呈負相關，提示血清CTRP12、APN具有代替磁共振成像技術用于評估腦動脈斑塊的潛力。進一步分析可知[15,20]：動脈斑塊是由血液中的血脂加上局部炎癥細胞等物質沉積在血管壁上而引起動脈血管壁變厚、血管變硬，所以脂質代謝紊亂和慢性炎癥在動脈粥樣硬化的發病機制中起關鍵作用。而作為脂肪因子的CTRP12和APN不僅被證實參與脂質代謝調控，而且被發現可通過調控多個信號通路而抑制炎癥的發生，所以但CTRP12和APN在血清中的含量減少時，外周血脂代謝將出現異常以及炎癥反應增高，進一步導致動脈斑塊的形成和發展。

綜上所述，腦動脈粥樣硬化大鼠血清CTRP12和APN的表達水平降低，并且其與磁共振成像檢測的腦動脈斑塊個數、厚度和體積均呈負相關，具有代替磁共振成像技術用于評估腦動脈斑塊的潛力。