輔酶Q10對小鼠腦出血后神經(jīng)保護(hù)作用的實驗研究

李寶福，劉柏麟，袁 興，郝璞珩，鄧齊奇，孫皖秦

(西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院神經(jīng)外科,陜西 西安 710100)

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH) 是指原發(fā)性非外傷性的腦實質(zhì)血管破裂出血，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞供血不足以及周圍神經(jīng)組織受壓，進(jìn)而引發(fā)一系列代謝及功能障礙[1]。ICH作為臨床工作中的一種常見的腦卒中亞型，病情兇險，病死率、致殘率高，患者即使存活也會出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能損害[2-4]。近年來，有研究報道ICH后繼發(fā)性腦損傷是影響存活患者生活質(zhì)量的重要因素[5]。因此，ICH后及時干預(yù)繼發(fā)性損傷對患者的最終預(yù)后有重要意義[6]。繼發(fā)性損傷包括顱內(nèi)血腫、腦水腫、炎性反應(yīng)、鈣超載、自由基反應(yīng)等[7]。既往研究[8]表明，ICH后血腫壓迫效應(yīng)及周圍組織的炎性反應(yīng)是造成繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素之一。輔酶Q10(CoQ10)作為呼吸鏈中不可或缺的遞電子體，亦是胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，近年來逐漸成為研究熱點(diǎn)[9-11]。研究[12-15]發(fā)現(xiàn)，CoQ10有著清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫等作用。但其在神經(jīng)保護(hù)及ICH后繼發(fā)性腦損傷方面的研究仍然較少，所得結(jié)論還不足以說明CoQ10的治療效果。本研究采用膠原酶注射法建立小鼠腦出血模型，研究CoQ10對ICH小鼠的神經(jīng)功能、周圍組織水腫及炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物選用無特定病原體級動物C57WT小鼠54只，8周齡，體重20～25 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心；Ⅳ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司；立體定位儀購自北京眾實迪創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；CoQ10購于上海鼓臣生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 模型建立及分組 采用膠原酶注射法建立小鼠腦出血模型[16]。給予腹腔注射5%水合氯醛(0.1 ml/10 g)麻醉，將麻醉后的小鼠剪開頭皮，暴露顱骨，于前囟前方0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm進(jìn)行顱骨鉆孔，小鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，垂直鉆孔入針，深度約3.5 mm,在小鼠基底神經(jīng)節(jié)的部位注射1 μl Ⅳ型膠原酶，在實驗規(guī)定時間處死模型小鼠，觀察其顱內(nèi)出血情況。將小鼠分為Sham組(Sham組小鼠只暴露顱骨，不進(jìn)行鉆孔和注射)、ICH組和CoQ10組，每組18只，其中6只用于檢測腦組織水含量和mNSS評分，6 只用于酶聯(lián)免疫吸附檢測炎癥因子水平，6只用于檢測細(xì)胞凋亡水平。CoQ10組腦出血模型建立6 h后，用30 mg/(kg·d)CoQ10灌胃，ICH組和Sham組用等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，共1周。過程中出現(xiàn)小鼠死亡要及時補(bǔ)充。

1.3 神經(jīng)功能缺損評分 模型建立7 d后，對三組小鼠進(jìn)行mNSS評分，分別從運(yùn)動、感覺、平衡、反射方面測試小鼠的神經(jīng)功能，不能完成某項測試項目則記1分，即得分越高，小鼠神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。mNSS評分為0～18分，0分為正常。

1.4 腦水含量計算 造模7 d給藥后，處死麻醉后小鼠，取出腦組織，立即稱量濕重，在120 ℃烘箱烘干至恒重，稱量干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重 ×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測腦組織炎癥因子表達(dá)水平 取損傷區(qū)周圍大腦皮層組織并勻漿，然后在4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液用于檢測。根據(jù)制造商說明，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒檢測細(xì)胞因子白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。先使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將樣品測得的吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算小鼠腦組織中IL-6及TNF-α水平。

1.6 TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡水平 灌注取腦后，將腦樣品浸泡在30%的蔗糖中，直至沉到底部。然后冰凍切片，切片厚度20 μm。4%的多聚甲醛在室溫固定 15 min后，用 PBS 在室溫漂洗三次×10 min。 然后切片在含 0.1% Triton-X-100 的 PBS 孵育15 min。 再次 PBS 室溫漂洗三次× 10 min，用5%的BSA封閉1 h。采用商業(yè)試劑盒進(jìn)行TUNEL染色，根據(jù)廠商說明，配制TUNEL溶液并避光孵育10 min，PBS清洗后用DAPI覆蓋切片，再次清洗、封片。切片在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，計算TUNEL陽性細(xì)胞百分比。TUNEL陽性細(xì)胞百分比=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)量×100%。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 于給藥7 d后進(jìn)行mNSS評分，結(jié)果顯示ICH組神經(jīng)功能缺損評分均明顯高于Sham組(P<0.001)，表明建模成功，而經(jīng)CoQ10治療的小鼠神經(jīng)功能缺損均得到明顯改善(P<0.05)，見圖1。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001；CoQ10組與ICH組比較，*P<0.05

2.2 三組小鼠腦水腫程度比較 于給藥7 d后通過小鼠腦組織干重濕重的測量值計算腦組織水含量從而評估小鼠腦水腫的程度，結(jié)果表明，與Sham組相比，ICH組腦水腫程度顯著增高(P<0.001)；與ICH組相比，CoQ10組腦水腫程度明顯降低(P<0.01)。見圖2。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與 CoQ10組比較，**P<0.01；CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

2.3 三組小鼠腦組織細(xì)胞凋亡水平比較 TUNEL染色結(jié)果表明，ICH組小鼠TUNEL陽性細(xì)胞的百分比明顯高于Sham組(P<0.001)；而經(jīng)CoQ10治療好，其百分比要明顯下降(P<0.001)，表明CoQ10可減少腦出血小鼠的細(xì)胞凋亡。見圖3。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，***P<0.001

2.4 三組小鼠腦組織炎癥因子水平比較 與Sham組相比，ICH組小鼠腦組織IL-6、TNF-α的濃度明顯增高(均P<0.001)；給予CoQ10治療后，小鼠腦組織中炎癥因子濃度降低(均P<0.01)。見圖4、5。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

3 討 論

ICH是一種常見的有著較高致殘率和病死率的腦卒中類型，由于腦出血后腦損傷的發(fā)生，患者即使幸存，也多將面臨較低的生活質(zhì)量和較重的家庭、社會負(fù)擔(dān)[17]。

注：Sham組與ICH組比較，***P<0.001；Sham組與CoQ10組比較，***P<0.001;CoQ10組與ICH組比較，**P<0.01

ICH后的腦損傷大致可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷[18]。在原發(fā)性損傷中，出血量的多少決定著血腫對臨近腦組織的機(jī)械性壓迫程度，臨床上多采用手術(shù)清除血腫，然而這種方式并不能緩解治療腦出血后的繼發(fā)性損傷[19]。繼發(fā)性損傷機(jī)制復(fù)雜，包括血腦屏障損傷、腦水腫、細(xì)胞凋亡等，此外，炎性反應(yīng)也是腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要機(jī)制之一，腦出血后，小膠質(zhì)細(xì)胞等中樞神經(jīng)固有的免疫細(xì)胞激活，釋放大量炎癥因子包括IL-6、TNF-α等，進(jìn)而引起瀑布級聯(lián)反應(yīng)，影響患者預(yù)后[18-19]。雖然近年來有大量的研究讓人們對腦出血后腦損傷的病理生理機(jī)制的認(rèn)識有了很大提高，但仍然缺乏有效的診治手段以改善患者預(yù)后。因此，尋找有效的臨床措施以避免ICH后腦損傷非常有研究價值。CoQ10作為一種脂溶性醌類化合物，是胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化劑，有著清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫等作用[12-15]。CoQ10可用于治療各種與細(xì)胞能量代謝不佳或氧化損傷相關(guān)的疾病，目前其已在神經(jīng)、心血管、免疫和腫瘤疾病方面發(fā)揮作用。例如，多種心血管疾病如高血壓、心力衰竭、心肌病、動脈粥樣硬化等均與CoQ10的缺乏有關(guān)，補(bǔ)充CoQ10可在一定程度上對這些疾病產(chǎn)生治療作用[20-22]。還有研究報道，CoQ10有希望用于神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默病等，但其在神經(jīng)保護(hù)及ICH后繼發(fā)性腦損傷方面的研究仍然較少[23-24]。

本研究采用膠原酶注射法建立腦出血小鼠模型，在小鼠基底神經(jīng)節(jié)的部位注射 Ⅳ型膠原酶，該法建立的模型穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，且符合臨床患者病程的進(jìn)展[25]。接著我們研究了CoQ10對于腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。我們于腦出血小鼠模型建立后7 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分，結(jié)果表明ICH組小鼠神經(jīng)功能評分均明顯高于Sham組，而經(jīng)CoQ10治療的小鼠神經(jīng)功能評分明顯低于ICH組；此外，CoQ10組腦水腫程度也明顯低于ICH組，顯示CoQ10對腦出血小鼠具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步研究CoQ10對腦出血后炎性反應(yīng)的影響，我們通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測了小鼠腦組織中炎癥因子IL-6、TNF-α的水平，研究表明ICH組小鼠腦組織中IL-6、TNF-α的濃度明顯增高，這與過去的研究相印證，而給予CoQ10治療后，小鼠腦組織中IL-6和TNF-α濃度顯著降低，表明CoQ10治療可抑制腦出血后炎癥因子的產(chǎn)生，降低腦出血后的炎性反應(yīng)。最后我們進(jìn)行了細(xì)胞凋亡的檢測，結(jié)果顯示相較于Sham組，ICH組細(xì)胞凋亡明顯增加，而CoQ10治療較ICH組可以減輕細(xì)胞的凋亡。我們的研究表明，CoQ10具有對腦出血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用可能由CoQ10抑制小鼠腦出血后IL-6、TNF-α的釋放，進(jìn)而起到降低腦水腫程度，減少細(xì)胞凋亡等作用。

綜上，CoQ10可減輕腦出血小鼠神經(jīng)功能障礙，降低腦水腫程度，減少炎癥因子產(chǎn)生，改善細(xì)胞凋亡，其可能在腦出血后繼發(fā)性腦損傷方面發(fā)揮治療作用，但作用機(jī)制及臨床應(yīng)用范圍的還需要進(jìn)一步探索。