辛伐他汀對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠繼發(fā)性炎癥抑制作用及機(jī)制研究

李張珂，馬 濤，滿明昊，田 博

(1.西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院，陜西 西安 710100；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院，陜西 西安 710038)

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是戰(zhàn)爭(zhēng)時(shí)期及現(xiàn)代社會(huì)生活中一種臨床常見(jiàn)創(chuàng)傷類(lèi)型，具有發(fā)生率高、致殘率高和病死率高的特點(diǎn)[1]。TBI的病理過(guò)程包括原發(fā)機(jī)械性損傷與復(fù)雜的生化代謝機(jī)制改變而起的繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷即因外力所致的腦組織挫裂傷、出血和神經(jīng)元丟失等；繼發(fā)性損傷的病理機(jī)制，包括代謝毒物產(chǎn)生、氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等[2]。現(xiàn)有研究[3]表明，炎性反應(yīng)與TBI后繼發(fā)性腦損傷的進(jìn)展密切相關(guān)，對(duì)損傷的范圍與程度均有較大影響。因此，探索TBI后如何減輕繼發(fā)性炎性反應(yīng)，對(duì)改善患者的臨床結(jié)局有重要的意義和價(jià)值。辛伐他汀是一種半合成的他汀類(lèi)降脂藥物，由土曲霉素降解產(chǎn)物衍生而來(lái)，作為一種內(nèi)源性膽固醇抑制劑，可達(dá)到減少炎癥因子表達(dá)的效果，實(shí)現(xiàn)抗炎、抗凋亡、保護(hù)神經(jīng)功能、減少腦組織水腫的作用[4-5]。有研究[6]證實(shí)，辛伐他汀通過(guò)降低TLR4介導(dǎo)的NF-κB通路，進(jìn)而抑制白細(xì)胞介素1β (IL-1β)表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)降低腦出血后過(guò)度炎性反應(yīng)的效果。也有研究[7]發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對(duì)抑制平滑肌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移具有積極意義，能促使內(nèi)皮一氧化氮合成水平不斷上升，有效調(diào)節(jié)血管緊張度和內(nèi)皮功能，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。而在對(duì)于顱腦疾病的作用中，有研究[8-9]表明，辛伐他汀在腦出血患者的神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中可以起到積極作用。然而，關(guān)于辛伐他汀在TBI后炎性反應(yīng)的作用卻仍不明確。鑒于此，本研究通過(guò)觀察辛伐他汀對(duì)TBI小鼠預(yù)后的影響，探討辛伐他汀對(duì)于TBI的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 36只6～8周成年雄性C57小鼠，購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重20～25 g。在室溫23～28 ℃、濕度45%～50%、12 h明暗交替環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)4周。辛伐他汀(鈉鹽形式)購(gòu)自默克公司；各種手術(shù)器械購(gòu)買(mǎi)自西安福鑫醫(yī)療科技有限公司；0.9%氯化鈉溶液購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；水合氯醛購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組和模型建立：將36只小鼠隨機(jī)均分成三組：損傷組(TBI組)、損傷后應(yīng)用辛伐他汀組(DI組)和假手術(shù)組(Sham組)。各組均以10%的水合氯醛(10 mg)麻醉小鼠，手術(shù)區(qū)消毒剃毛，并沿中軸切開(kāi)頭皮；在左頂葉上方開(kāi)放直徑約3 mm的骨窗，放置墊片與直徑2 mm的撞針，在此期間注意保護(hù)硬膜的完整；進(jìn)而對(duì)TBI組和DI組小鼠進(jìn)行改良Feency自由落體撞擊造模，小鼠俯臥固定于撞擊器定位儀，40 g砝碼自35 cm沿長(zhǎng)管自由落體撞擊撞針；止血后，清洗傷口后縫合頭皮。Sham組的小鼠僅以相同操作開(kāi)骨窗后縫合，不進(jìn)行打擊。若小鼠在暫發(fā)的呼吸暫停和四肢抽搐后持續(xù)昏迷2 h以上，則判斷此次造模成功。

1.2.2 藥物干預(yù)：選用羧甲基纖維素鈉(0.5%)配置1.5 mg/ml辛伐他汀溶液，4 ℃保存。判斷造模成功后，DI組小鼠立即通過(guò)腹腔注射給藥，用量為20 mg/kg，Sham組和TBI組小鼠在同一時(shí)間點(diǎn)注射等體積量的0.9%氯化鈉溶液，每24 h注射1次，連續(xù)7次。

1.2.3 神經(jīng)損傷評(píng)分：TBI后第1、3、7天對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，本研究采用神經(jīng)損傷評(píng)分(mNSS)，依照測(cè)試量表操作，滿分為18分，試驗(yàn)小鼠所得評(píng)分越高即說(shuō)明神經(jīng)損傷越重。

1.2.4 腦組織含水量檢測(cè)：每組中隨機(jī)取3只小鼠，處死后取左側(cè)腦半球，過(guò)程中注意剔除腦膜和血塊；稱重后于烤箱中60 ℃烤至質(zhì)量不再改變，再次稱重，含水量即為烘烤過(guò)程中的腦組織質(zhì)量之差占原質(zhì)量的百分比。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)腦組織炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)：腦創(chuàng)傷后7 d，每組各取3只小鼠，于腹腔注射超量的戊巴比妥鈉溶液(80 mg/kg)處死小鼠，分離以損傷處為圓心直徑約5 mm的皮質(zhì)區(qū)域，期間注意操作應(yīng)快速進(jìn)行；加入合適劑量的RIPA裂解液后完全勻漿，待樣本徹底變性后，取等量樣本進(jìn)行電泳分離，等待溴酚藍(lán)位移到膠質(zhì)底部，而后電轉(zhuǎn)至孔徑為0.45 μm的硝酸纖維膜，即PVDF膜上；室溫下，采用5%的脫脂牛奶為封閉材料，封閉2 h；進(jìn)而添加一抗(TBK1，1∶1000;TLR4，1∶2000)，置于4 ℃條件下孵育過(guò)夜；第2天，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h后發(fā)光拍照。

1.2.6 ELISA檢測(cè)腦組織IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)：于造模成功的第7天，從三組中各自隨機(jī)抽選3只小鼠，用過(guò)量的戊巴比妥鈉(80 mg/kg)處死小鼠，在冰臺(tái)上，保證低溫條件，快速分離以損傷處為中心直徑5 mm皮質(zhì)區(qū)域；用ELISA試劑盒的規(guī)范步驟檢測(cè)腦組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)。

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)：各組取3只小鼠，7 d 后鼠腦整體取出后放入4%多聚甲醛溶液固定12 h，分別用20%、30%蔗糖溶液對(duì)腦組織進(jìn)行脫水至其可以沉于容器底部。冰凍切片厚度定為20 μm，于冰箱中-20 ℃保存，使用時(shí)復(fù)溫30 min。緩慢滴加0.3% Triton X-100溶液在切片表面，后選用10%驢血清封閉。一抗(封閉血清稀釋)混合后涂片，4 ℃層析過(guò)夜，與熒光素標(biāo)記的二抗混合，然后涂片。室溫孵育2 h，并在避光環(huán)境下進(jìn)行后續(xù)步驟。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min，共漂洗3次，最后滴加DAPI染液，對(duì)細(xì)胞核染色、封片、避光觀察。

2 結(jié) 果

2.1 辛伐他汀對(duì)TBI小鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響 Sham組小鼠在TBI后第1、3、7天的mNSS評(píng)分改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相比于Sham組，TBI組和DI組小鼠的mNSS評(píng)分顯著升高(均P<0.001)，與TBI組小鼠相比，DI組小鼠的評(píng)分明顯降低(均P<0.001)，即辛伐他汀有改善小鼠的神經(jīng)功能的作用。見(jiàn)圖1。

注：各組兩兩比較，*P<0.05，△P<0.01，#P<0.001

2.2 辛伐他汀對(duì)TBI小鼠腦組織含水量的影響 相較于Sham組[(76.10±0.42)%]，損傷后TBI組小鼠腦組織含水量明顯上升[(87.38±3.12)%,P<0.001]；而對(duì)比TBI組辛伐他汀治療能夠顯著降低TBI小鼠腦組織含水量[(80.75±0.98)%,P<0.05]。見(jiàn)圖2。

注:各組兩兩比較，△P<0.01，#P<0.001

2.3 辛伐他汀對(duì)TBI小鼠腦組織中炎癥因子表達(dá)的影響 與Sham組比較,TBI組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β的表達(dá)上調(diào)(均P<0.001)；而對(duì)比TBI組，DI組的辛伐他汀治療可以降低小鼠腦組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)(均P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注:各組兩兩比較，△P<0.01，#P<0.001

2.4 辛伐他汀對(duì)TBI小鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 術(shù)后7 d后對(duì)小鼠腦組織做免疫熒光檢測(cè)TBI后腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，與Sham組相比，TBI組小鼠損傷區(qū)周?chē)M織中出現(xiàn)了大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，其特征為胞體較大突起變短，呈典型阿米巴樣；而DI組的小膠質(zhì)細(xì)胞相較TBI組數(shù)量上有明顯減少，且出現(xiàn)胞體變小突起變長(zhǎng)的現(xiàn)象，即辛伐他汀抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。見(jiàn)圖4。

圖4 三組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)比較(免疫熒光染色，×200)

2.5 辛伐他汀對(duì)TBI小鼠腦組織中炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較，TBI小鼠腦組織中TBK1、TLR4蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.01)；相較于TBI組，DI組中的辛伐他汀治療可以降低炎癥信號(hào)通路相關(guān)的TBK1(P<0.01)、TLR4(P<0.05)蛋白含量。見(jiàn)圖5。

注:各組兩兩比較， *P<0.05，△P<0.01

3 討 論

既往報(bào)道顯示，神經(jīng)炎性反應(yīng)的機(jī)制包括腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞激活、外周循環(huán)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥細(xì)胞因子(如趨化因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子)等介質(zhì)的釋放；在組織受損初期，適當(dāng)?shù)难仔苑磻?yīng)能夠清除壞死的組織細(xì)胞，為神經(jīng)修復(fù)提供相宜的微環(huán)境，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[10]。然而，研究證據(jù)進(jìn)一步揭示，隨著小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)異常活化，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過(guò)CD14依賴途徑對(duì)神經(jīng)元直接產(chǎn)生毒性作用，而被激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的神經(jīng)毒性物質(zhì)，通過(guò)分泌TNF-a、IL-6、ApoE以及S100β蛋白等胞外酶加重炎性反應(yīng)，造成神經(jīng)組織的進(jìn)一步損傷；失控的神經(jīng)炎性反應(yīng)可加重TBI繼發(fā)的腦組織水腫，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，影響腦組織的供血情況，進(jìn)而壓迫正常的神經(jīng)組織，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，限制傷后機(jī)體的恢復(fù)和相關(guān)功能的預(yù)后[11-13]。因此，TBI后抑制或減輕炎性反應(yīng)對(duì)于患者神經(jīng)功能的保護(hù)及臨床結(jié)局有著重要的意義[14]。

辛伐他汀作為內(nèi)源性膽固醇抑制劑，是一種臨床上常用的他汀類(lèi)降脂藥，研究[6，15-18]發(fā)現(xiàn)，其可改善血管內(nèi)皮功能、抗血小板聚集、改善高血脂高血壓、調(diào)節(jié)骨代謝水平、降低哮喘癥狀和抑制炎性反應(yīng)。還有研究[19]證實(shí)，辛伐他汀能夠顯著降低IL-1、Caspase-1、IL-18及NLRP3蛋白的表達(dá)水平，具有改善阿爾茨海默小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力的作用。在急性腦梗死患者治療中，辛伐他汀也有顯著的療效，可明顯地降低患者神經(jīng)功能損傷程度，改善患者的臨床結(jié)局[20]。此外，辛伐他汀對(duì)腦動(dòng)脈粥樣硬化患者具有降低炎性因子水平的作用，并且在臨床上聯(lián)合抗栓治療干預(yù)腦梗死效果顯著，能夠明顯降低血脂和炎性因子含量[21-22]。然而，有關(guān)辛伐他汀對(duì)TBI后繼發(fā)性炎性反應(yīng)的治療作用仍然缺少相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究辛伐他汀對(duì)于TBI后炎性反應(yīng)相關(guān)因素的影響，探討辛伐他汀對(duì)于TBI后炎性反應(yīng)的抑制作用及機(jī)制。

本研究中，我們通過(guò)比較Sham組、TBI組和DI組中小鼠造模手術(shù)后第1、3、7 天的mNSS評(píng)分發(fā)現(xiàn)，造模手術(shù)后，TBI組、DI組的神經(jīng)功能受到明顯損害；而在用藥后DI組mNSS評(píng)分較TBI組有所降低，說(shuō)明辛伐他汀對(duì)小鼠的神經(jīng)功能起到了一定的保護(hù)作用；進(jìn)一步檢測(cè)各組小鼠腦組織含水量，結(jié)果顯示，相較于Sham組，TBI組的小鼠腦組織含水量有明顯升高，而辛伐他汀干預(yù)后，DI組小鼠的腦組織含水量明顯降低；此后我們以ELISA法對(duì)各組小鼠腦組織中炎癥因子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)TBI組與DI組小鼠的TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平較Sham組明顯上調(diào)，對(duì)比TBI組與DI組數(shù)據(jù)，顯示辛伐他汀的干預(yù)同時(shí)下調(diào)了該兩種主要炎癥因子TNF-α、IL-1β在DI組小鼠組織中的表達(dá)水平；進(jìn)一步利用免疫熒光法觀察了各組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度，結(jié)果證實(shí)，與TBI組相比，應(yīng)用辛伐他汀干預(yù)后，DI組小鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)明顯發(fā)生改變，其胞體變小，突起變長(zhǎng)，提示應(yīng)用辛伐他汀后可有效抑制損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)；最后，我們以Western blot法探究炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白TBK1、TLR4在受損組織中的表達(dá)，數(shù)據(jù)表明，相較于Sham組，TBI組與DI組的小鼠腦組織的蛋白表達(dá)明顯升高，對(duì)比TBI組，DI組小鼠的受損區(qū)域腦組織中TBK1、TLR4蛋白表達(dá)顯著降低。

綜上所述，本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)，下調(diào)TBK1、TLR4等炎癥信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)一步降低下游TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達(dá)，抑制了過(guò)強(qiáng)的炎性反應(yīng)，從而有效降低TBI小鼠mNSS評(píng)分，保護(hù)了小鼠傷后的神經(jīng)功能，提高了小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，其分子機(jī)制可能是通過(guò)降低TBI小鼠腦組織中TBK1、TLR4蛋白的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。接下來(lái)的研究工作，應(yīng)繼續(xù)探索辛伐他汀作為T(mén)BI的治療手段應(yīng)用臨床的可行性，以及相應(yīng)的施藥時(shí)機(jī)、使用劑量、持續(xù)時(shí)間對(duì)TBI后繼發(fā)炎性反應(yīng)療效的影響，以期早日服務(wù)于臨床實(shí)踐。