紫杉醇促進(jìn)心肌細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上調(diào)HO-1表達(dá)預(yù)防再灌注損傷的機(jī)制研究

周 樂，徐佩爾，鄭玉婷，陸瑾玥，顧佳妮，胡 牽，宮悅?cè)A，顏雪蕓，曹華明

(1.上海市靜安區(qū)市北醫(yī)院心內(nèi)科，上海200435;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)教育基地,上海201203)

據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，缺血性心臟病是全球第一主要死因。心肌缺血組織的及時(shí)再灌注是治療干預(yù)的關(guān)鍵步驟。然而，突然再灌注可導(dǎo)致進(jìn)一步的心肌損傷，稱為心肌缺血/再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷[1-3]。MI/R的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括細(xì)胞內(nèi)鈣過載、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損傷、細(xì)胞凋亡和自噬、炎癥等[4]。在MI/R損傷后的心臟功能障礙期間，氧化應(yīng)激會產(chǎn)生有害影響。氧化應(yīng)激是高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)、活性氮、超氧陰離子、羥基自由基和過氧亞硝酸鹽的過度積累或去除不足導(dǎo)致的[5-6]。在心臟正常生理?xiàng)l件下，98%耗氧用于產(chǎn)生三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，缺氧情況下，心肌能量代謝發(fā)生紊亂，ATP生成不足并迅速耗竭，并產(chǎn)生大量ROS。ROS的過度產(chǎn)生和積累不僅會引起線粒體膜氧化損傷，還會誘導(dǎo)微管等細(xì)胞骨架的破壞。心肌細(xì)胞中的微管可以通過某些陰離子通道控制線粒體外模對代謝物的通透性，調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝[7]。微管若損傷，不能對心肌細(xì)胞起到支撐定型作用，會對DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成極大的損傷，降低心肌細(xì)胞穩(wěn)定性，增加細(xì)胞脆性。導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞凋亡等[8]。因此，抑制氧化應(yīng)激可能對預(yù)防MI/R具有重要意義。

有研究[9-10]表明，紫杉醇(Paclitaxel,PTX)能夠作為微管穩(wěn)定劑，能夠抑制微管解聚，減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷。而血紅素加氧酶(Heme oxygenase，HO)是血紅素降解的限速酶，HO通過對催化血紅素環(huán)裂解形成亞鐵、一氧化碳和膽綠素的過程進(jìn)行限速來保護(hù)細(xì)胞，防止MI/R損傷。HO有三種異構(gòu)體，其中HO-1 受到多種生理和病理生理刺激的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，包括血紅素、炎性細(xì)胞因子和一氧化氮等。Lee等[11]的研究證實(shí)，HO-1的調(diào)控與絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)通路密切相關(guān)，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)和氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和 p38 MAPK 途徑。而MAPK在細(xì)胞過程中影響細(xì)胞的增殖、應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡和免疫防御[12]。因此本次研究旨在探討促進(jìn)心肌細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上調(diào)HO-1表達(dá)是否能夠預(yù)防心肌的再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只6周齡雄性SD大鼠，體重230～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司[生產(chǎn)使用合格證號：SCXK(京)2018-0013]。使用標(biāo)準(zhǔn)籠和常規(guī)飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)期間實(shí)驗(yàn)用鼠自由飲水進(jìn)食。

1.2 心肌缺血再灌注模型的構(gòu)建 大鼠腹腔注射0.2 ml/100 g戊巴比妥鈉麻醉后，迅速從大鼠體內(nèi)分理出心臟置入0 ℃ K-H緩沖液中漂洗停跳。然后將心臟快速固定于 Langendorff灌流裝置，進(jìn)行主動脈常氧恒流灌流。灌流液采用95% O2和5% CO2鼓泡式氧合的K-H緩沖液，灌注壓維持75 mmHg，pH=7.35～7.45，37 ℃持續(xù)20 min。平衡灌注后觀察心臟搏動情況[13]，對于符合《離體心臟缺血再灌時(shí)間與損傷模型的合理評價(jià)》[14]入選標(biāo)準(zhǔn)的大鼠進(jìn)行后續(xù)研究。對于心肌缺血再灌注大鼠進(jìn)行前降支結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈30 min誘導(dǎo)缺血。若冠脈流量降低25%則說明結(jié)扎成功阻斷血流[15]。

1.3 分組和干預(yù) 30只大鼠被隨機(jī)均分為對照組、缺血組和PTX組，每組共10只大鼠。對照組：20 min平衡期后，接受常氧灌注120 min；缺血組：20 min平衡期后，進(jìn)行30 min缺血前降支結(jié)扎，隨后接受常氧灌注120 min；PTX組：20 min平衡期后，進(jìn)行30 min缺血前降支結(jié)扎，隨后加入就含有1 μmol/L的PTX常氧灌注液灌注120 min。

1.4 檢測方法

1.4.1 微管損傷檢測：灌流結(jié)束時(shí)用高碘酸賴氨酸多聚甲醛固定劑灌注心肌組織，然后剪下左心室肌在PBS中清洗，制成冰凍切片并進(jìn)行微管和肌絲蛋白雙染色。加入1∶300 稀釋的單克隆抗體-β微管蛋白抗體及1∶300 稀釋的熒光異硫氰酸酯標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白進(jìn)行溫育。其他切片在室溫下用1∶70稀釋的鬼筆環(huán)肽溫育20 min，然后用PBS沖洗。在熒光顯微鏡下檢測。

1.4.2 信號通路的藥理學(xué)抑制實(shí)驗(yàn)：為了研究PTX治療有效的相關(guān)分子機(jī)制，另選30只大鼠隨機(jī)分為三組：缺血組2組、PTX2組 (1 μmol/L) 和秋水仙堿組(1 μmol/L)，每組10只。用戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉動物。同1.2方式進(jìn)行造模。將三組大鼠灌流液中分別加入1 μmol/L的JNK抑制劑JNK-IN-8、10 μmol/L的 p38 MAPK抑制劑Adezmapimod、10 μmol/L的MEK1抑制劑AZD6244。再灌注結(jié)束后，迅速分離心肌組織，收集心肌細(xì)胞在室溫下被儲存在含1 μmol/L氯化鈣的臺氏液中。溫育后，用PBS沖洗，然后用含有蛋白酶抑制劑Cocktail的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解。用BCA蛋白定量分析試劑盒對蛋白進(jìn)行分析，等量的總細(xì)胞裂解物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離，然后轉(zhuǎn)移到聚乙烯膜PVDF上。室溫下封入BSA封閉液(5% PBS緩沖液+0.1%吐溫20)1 h。加入初級抗體，在室溫下按1∶1000～1∶2000 的體積比，將適當(dāng)次級抗體加入PBS+0.1%吐溫20中1 h，用通過ECL試劑盒探測信號。

2 結(jié) 果

2.1 PTX降低微管缺血損傷 通過免疫組織化學(xué)分析微管形態(tài)(圖1)。在對照組中可見微管結(jié)構(gòu)完整，無明顯斷裂；在缺血組中可見微管連續(xù)中斷，微管斷裂；在PTX組中可見微管結(jié)構(gòu)基本完整，但微管稍有粗亂。表明PTX能夠降低微管缺血損傷。

圖1 對照組、缺血組和PTX組的微管形態(tài)結(jié)構(gòu)(免疫熒光，×400)

2.2 PTX能夠誘導(dǎo)微管蛋白表達(dá)并可能通過激活JNK途徑誘導(dǎo)心臟心肌細(xì)胞中HO-1基因表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡分析缺血2組、PTX2組以及秋水仙堿組大鼠心肌細(xì)胞中微管蛋白和HO-1 相關(guān)基因的表達(dá)(圖2)。PTX2組微管蛋白的表達(dá)水平明顯高于的缺血2組和秋水仙堿組，秋水仙堿處理過的微管蛋白的表達(dá)水平最少。通過密度分析來量化蛋白表達(dá)水平和磷酸化水平在三種MAPK(ERK、JNK、p38)中的活性，只有JNK磷酸化水平在PTX組中被顯著誘導(dǎo)，在秋水仙堿組中降低。這表明PTX可能借助JNK1信號誘導(dǎo)增加HO-1表達(dá)而保護(hù)心臟心肌細(xì)胞抵御MI/R損傷。

注:與缺血2組比較，*P<0.05

2.3 PTX激活JNK誘導(dǎo)HO-1表達(dá) 見圖3。

注:與PTX-Adezmapimod組比較，*P<0.05

AZD6244、Adezmapimod和JNK-IN-8 三種MAPK抑制劑分別用來研究被PTX激活的JNK是否調(diào)節(jié)HO-1表達(dá)。發(fā)現(xiàn)AZD6244和Adezmapimod沒有改變PTX誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。相比之下，JNK-IN-8顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)。表明PTX通過激活JNK來誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。

3 討 論

缺血缺氧會引起細(xì)胞離子通道改變、鈣超載，破壞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨架蛋白損傷或缺失，在缺氧或缺血期間，細(xì)胞骨架的紊亂引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性改變。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞重建過程中，細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白和離子通道蛋白的表達(dá)上調(diào)。 Wei等[16]研究證明增加熱休克蛋白的表達(dá)，能夠與肌動蛋白相結(jié)合并穩(wěn)定肌動蛋白的細(xì)胞骨架，從而心肌增強(qiáng)細(xì)胞對MI/R的抵抗力[17-18]。

p38MAPK、ERK1/2和JNK三種激酶是絲裂原活化蛋白激酶重要組成部分，MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)時(shí)有著十分重要的作用，其廣泛存在于細(xì)胞的生長繁殖、分裂死亡以及細(xì)胞內(nèi)各種生化反應(yīng)信號的變化過程中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和死亡等生物過程[19]。研究[20]發(fā)現(xiàn)，JNK和p38MAPK的激活會促使細(xì)胞凋亡，而ERK1/2的激活會抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在心臟心肌細(xì)胞中PTX能激活被證實(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的JNK，介導(dǎo)HO-1表達(dá)。JNK-IN-8(JNK特異性抑制劑)，能顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)。

我們發(fā)現(xiàn)作為微管穩(wěn)定劑能有效地減少M(fèi)I/R損傷時(shí)的ROS水平，這與以前的研究結(jié)果一致。線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ是產(chǎn)生細(xì)胞ROS的主要來源，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PTX能顯著保護(hù)缺血時(shí)這兩種酶活性。此外，既往研究中，發(fā)現(xiàn)HO-1能顯著增加大腦對缺血性氧化應(yīng)激的抵抗[21]，HO-1的過表達(dá)也顯示出對MI/R損傷的保護(hù)作用。本研究中，我們對缺血時(shí)PTX是否誘導(dǎo)HO-1進(jìn)行了研究，結(jié)果證實(shí)缺血時(shí)PTX能誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。JNK-IN-8，一種JNK特異性抑制劑，能顯著抑制PTX誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)，這或許是PTX在MI/R損傷期間能保護(hù)但不能殺死心臟心肌細(xì)胞的原因之一。

在MI/R中，細(xì)胞骨架損害會導(dǎo)致細(xì)胞破裂和誘發(fā)凋亡，因此從保護(hù)細(xì)胞骨架穩(wěn)定或加強(qiáng)受損細(xì)胞骨架及其相關(guān)蛋白的修復(fù)來進(jìn)行心臟保護(hù)，可能是今后治療缺血型心臟病的有效靶點(diǎn)及研究方向。對進(jìn)一步探討心肌缺血的機(jī)制研究具有重要意義。